一种灌流式细胞培养的培养基更换方法技术

本发明专利技术公开了一种灌流式细胞培养的培养基更换方法，它包括如下步骤：(1)降温：降低细胞培养罐内培养基的温度至4～15℃；(2)通氧：通入氧气至培养基的溶氧量为150～250％(mg/L)；(3)更换培养基：停止搅拌，沉降细胞，沉降时间为0～48h，抽出上清液，加入新鲜培养基。本发明专利技术还公开了一种搅拌式细胞培养罐，以及一种细胞培养方法。本发明专利技术培养方法可以克服现有细胞灌流培养方法存在设备复杂、成本高的缺点，具有实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及ー种哺乳动物细胞灌流培养方法。
技术介绍
随着基因工程的发展，人们逐渐认识到许多生物制品不能在原核细胞内正确表达，它们需要经过真核细胞所特有的翻译后修饰，以及正确的切割、折叠后，才能形成与自然分子一祥的功能和抗原性，使得动物细胞ー跃成为ー种重要的宿主细胞，用以生产各种各样的生物制品，因而，哺乳动物细胞大規模エ业化培养成为生物药物生产的关键。目前，动物细胞株培养需要解决的核心问题包括如下三个如何提高细胞密度，如何长时间維持细胞活力，如何提供高表达所需的营养环境以及良好的物理化学环境。灌流式培养，又称灌注培养，是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和 产物形成过程中，不断地将部分培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基的细胞培养方式。灌流式培养大致可以解决上述动物细胞株培养的三个问题连续灌注的培养基可以提供充分的营养成分，带走代谢副产物，给细胞生长提供优良的环境，细胞密度高，表达时间长，可以大幅度提高生产产率。实现细胞灌流培养的核心技术是如何有效地进行细胞截留(将细胞与培养基分离)，即如何在保证细胞密度和细胞活力的基础上更换培养基。目前，有效地解决方法在于使用细胞截流装置。常用的细胞截留装置是沉降截留装置，其中，倾斜式重力沉降器因设备简单、对细胞造成的损伤较小、操作简易，已用于杂交瘤和CHO细胞连续灌注培养(吕中华等，哺乳动物细胞灌注培养エ艺研究进展，中国中医药咨讯，2011年7月第3卷第20期)。用倾斜式细胞重力沉降器进行细胞截留，需将细胞悬液从生物反应器中取出，加入沉降器中，细胞悬液进入沉降器以后，大部分活细胞在垂直沉降区沉降，并从底端出料ロ流出，回流至生物反应器；少量细胞向上流动，留在倾斜沉降区；沉降上清液从上部的排液ロ排出，工作前沉降器内的空气从排气ロ排出。使用截留装置截留细胞，必须要将含有活细胞的培养液抽出，离开原培养环境，且需在沉降装置中停留一段时间，无法到达原位整体分离的目的，存在细胞损伤、反应器环境恶化等问题，且细胞截留装置价格昂贵，生产成本高，难以实现大规模エ业化生产。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了ー种灌流式细胞培养的培养基更换方法和灌流式细胞培养方法。本专利技术提供了ー种灌流式细胞培养的培养基更换方法，它包括如下步骤(I)降温降低细胞培养罐内培养基的温度至4 15°C ；(2)通氧通入氧气至培养基的溶氧量为150 250% (mg/L)；(3)更换培养基停止搅拌，沉降细胞，沉降时间为O 48h，抽出上清液，加入新鮮培养基。其中，步骤(I)所述温度为8 12°C。其中，步骤⑵所述溶氧量为250% (mg/L)。其中，步骤(3)所述沉降时间为15_36h。所述沉降时间进一歩优选为20_36h，再进ー步优选为20-24h。其中，所述细胞为哺乳动物细胞。其中，所述哺乳动物细胞为中国仓鼠卵巢细胞、小鼠骨髓瘤细胞、人胚胎肾细胞、骨髓瘤细胞或者HEK293细胞、BHK细胞。 其中，所述哺乳动物细胞为制备生物制品的细胞。本专利技术可以提高由动物细胞表达的蛋白或抗体等生物制品的产量，例如单克隆抗体、生长因子和酶、DNA、疫苗等，根据本专利技术生产的生物制品，具有医药用途，如阿伐他汀(atorvastatin)，卵泡刺激素(Gonal-F),曲妥株单抗Trastuzumab (Herceptin ),托株单抗注射液Tocilzumab (actemra ),帕利珠单抗 Palivizumab (aynagis ),抗 CD20 抗体(Rituximab)，狄诺赛单抗denosumab (ProliaTM),卡那奴单抗canakinumab (LlarisTM),氟替卡松+沙美特罗(salmeterol plus fluticasone),奥马珠单抗 Omalizumab (X olair ), TNFRII-Fc 融合蛋白，商品名为(enbrel ),埃索美拉唑(esomeprazole),纟颜沙坦(valsartan)等。本专利技术还提供了一种用于前述方法的细胞培养罐，所述搅拌式细胞培养罐包括罐体(1)，罐体(I)上设置导流管(3)，导流管(2)上设置开关(7)，罐体(I)内部设置搅拌器(2)，罐体⑴外部设置夹套(4)，夹套(4)通过循环管(5)与温度调节器(6)连接。其中，所述搅拌器(3)为桨叶式搅拌器。本专利技术还提供了ー种灌流式细胞培养方法，它包括如下步骤①取细胞，经过复苏、传代后，接种至搅拌式细胞培养罐中搅拌培养，培养温度30 0C -37 0C ；②结束培养，按照前述的方法，更换培养基；③升高培养基温度至30 37°C，继续培养。本专利技术提供的灌流式细胞培养的培养基更换方法，通过调节细胞培养的温度和溶氧等參数，无需使用传统细胞截留装置，原位分离细胞培养基和细胞，在保证细胞密度和细胞活力的基础上更换培养基，实现细胞高密度连续培养，且可以充分利用培养基，勿需消耗大量培养基，克服了传统细胞灌流培养方法的缺陷，操作简单，生产成本低。同时，本专利技术提供的哺乳细胞培养方法还可以极大地提高目标产物的表达量，实现了生物制品的大規模エ业化多批次连续培养生产，具有エ业应用价值。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进ー步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图I本专利技术搅拌式细胞培养罐结构示意图。其中，I为罐体,2为导流管，3为搅拌器，4为夹套，5为循环管，6为温度调节器，7为开关图2本专利技术灌流方法示意3培养CHO-TNFRII-Fc细胞五轮次(C1-C5)细胞显微图(10X 10倍放大)图4培养CHO-TNFRII-Fc细胞五轮次蛋白表达情况图5细胞沉降效率与时间关系图具体实施例方式实施例I表达重组人TNFRII-Fc的CHO细胞的重组蛋白的生产I、材料设备 细胞株表达重组人TNFRII-Fc 的 CHO 细胞(CHO-TNFRII-Fc)培养基EX-CELLTM 302 无血清培养基(Sigma，M326C-IOOL)其它材料碳酸氢钠(Sigma,S5761-5KG)、L-谷氨酰胺(Sigma, G8540-1KG)、葡萄糖(分析纯，成都科龙化工试剂厂)细胞培养罐BC_150L搅拌式细胞培养罐(广州奇志)；BC_7. 5L搅拌式细胞培养罐(广州奇志)或者本专利技术搅拌式细胞培养罐，如图I所示，该搅拌式细胞培养罐包括罐体1，罐体I上设置导流管2，导流管2上设置开关7，罐体I内部设置搅拌器3，罐体I外部设置夹套4，夹套4通过循环管5与温度调节器6连接。其中，所述搅拌器3为桨叶式搅拌器制冷设备LD_30低温水冷式冷水机(北京环球联合机电设备有限公司)倒置显微镜凤凰XDS200倒置生物显微镜细胞染色液溶于IXPBS的4%台盼蓝血小板计数板HPLC :Agilent 1260 高效液相色谱仪分析柱HiTrapProtein A HP IML 预装柱缓冲液平衡液，20mM磷酸盐缓冲液，pH7. O ;洗脱液A，IM氯化钠，20mM磷酸盐缓本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.ー种灌流式细胞培养的培养基更换方法，其特征在于它包括如下步骤 (1)降温降低细胞培养罐内培养基的温度至4 15°C； (2)通氧通入氧气至培养基的溶氧量为150 250%(mg/L)； (3)更换培养基停止搅拌，沉降细胞，沉降时间为O 48h，抽出上清液，加入新鲜培养基。2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤⑴所述温度为8 12°C。3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(2)所述溶氧量为250%(mg/L)。4.根据权利要求I所述的方法，其特征在于步骤(3)所述沉降时间为15-36h。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述沉降时间为20-36h。6.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述细胞为哺乳动物细胞。7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于所述哺乳动物细胞为中...

【专利技术属性】
技术研发人员：董佳里，钟邵东，曹路君，吴浪波，吴城，齐欣，高燕，王金蓉，周丽微，鲁艳，彭红卫，赵斌，徐小萍，
申请(专利权)人：苏州金盟生物技术有限公司，天津博发生物技术有限公司，成都金凯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：