筛选生产底物广泛性的腈水解酶的菌株的方法技术

本发明专利技术提供了一种筛选生产底物广泛性腈水解酶的菌株的方法。具体地说，本发明专利技术提供了一种利用三羟基丙腈作为筛选压力和氮源，筛选生产底物广泛性腈水解酶的菌株的方法。由通过该方法筛选获得的菌株所生产的腈水解酶具有较好的底物广泛性，能够水解羟基腈、普通腈类及芳香腈类产生相应的羧酸。该方法筛选获得菌株所生产的腈水解酶具有很好的底物广泛性，并且存在着水解条件温和、环境友好等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及ー种从土壌、环境污染物、水体等样品中筛选获得能够生产具有较好的底物广泛性、能够水解羟基腈、普通腈类及芳香腈类的腈水解酶的菌株的方法。
技术介绍
月青水解酶包括腈水解酶(Nitrilase)和腈水合酶(Nitrilehydratase),前者可以催化腈直接水解生成羧酸及氨；而后者可以催化腈水解生成酰胺，酰胺在酰胺酶(Amidase)作用下进ー步转化成羧酸及氨。传统化学方法利用腈类合成相应羧酸类需要在强酸性、高温环境中进行，而且合成过程中会有大量的副产物产生，合成效率低下，分离产物困难。利用腈水解酶(包括菌体及纯化后蛋白质)催化腈化物的水解具有高选择性、高效性、条件温和、环境污染小、成本低、产物光学纯度高等优点，与传统的化学方法相比，有着无可比拟的优越性。利用腈水解酶降解腈化合物，用于合成手性的羧酸和酰胺等医药中间体，此外腈水解酶及其产生菌还可用于食品、电镀厂等腈污染废水的生物治理。腈水解酶可广泛应用于精细化工、医药、食品、农业及畜牧业等方面。来源于绿针假单胞菌(Pseudomonaschlororaphis B23)及红球菌(Rhodococcusrhodochrous)Jl的腈水解酶已经应用于エ业生产，使得年产丙烯酰胺达30000吨以上。经证实在不同属(农杆菌属、节杆菌属、棒杆菌属、假单胞菌属和红球菌属)的若干细菌种中都有腈水解酶存在，并从多种生态系统中得以分离，例如，热湖的沉积物、深海沟渠、腈污染的土壤等。此外，黑曲霉(Aspergillus niger)、串珠赤霉菌(Gibberella moniliformis)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)的几个真菌菌属中，也发现腈类降解活性的报道。底物广泛性良好的腈水解酶在除去食品、饮料及环境中腈类污染的治理方面存在着独特的优势，具有重要的开发价值。目前腈水解酶的筛选方法多采用2-羟基腈类如2-羟基こ臆、2-羟基丙腈等作为筛选压カ筛选具有较好的催化专ー性的腈水解酶，用于催化合成高纯度、具有旋光性的手性化合物。但这些筛选方法都不能获得底物广泛性的腈水解酶。到目前为止，未发现筛选具有较好的底物广泛性的腈水解酶的方法报道。本方法利用3-羟基丙腈作为筛选压力和筛选氮源，充分利用β -位羟基的结构，使得筛选到的腈水解酶菌株所产腈水解酶既能够降解普通腈类，又能够降解羟基腈和带芳香环的腈类，具有较好的底物广泛性。经检索国内外没有以3-羟基丙腈作为筛选压力和氮源筛选产腈水解酶的菌株的方法及筛选底物广泛性腈水解酶的方法。
技术实现思路
本专利技术针对现当前腈水解酶市场需求，特别是对于具有底物广泛性腈水解酶的需求，以三羟基丙腈作为筛选压カ和氮源，利用Berthelot显色法进行初歩測定，结合高压液相对高效产氨菌株进行进一步确认，建立了筛选生产底物广泛性的腈水解酶的菌株的筛选方法。本方法既通过Berthelot显色法提高了筛选的效率，又通过高压液相保证了筛选的准确度，经检验利用三羟基丙腈筛选到的菌株所生产的腈水解酶都具有较好的底物广泛性。本专利技术还涉及通过上述筛选方法筛选得到的菌株。通过本专利技术的筛选方法筛选到的菌株主要属于假单胞菌属、泛菌属。本专利技术还涉及由所筛选的菌株所产生的底物广泛性的腈水解酶。具体地，本专利技术涉及ー种，本筛选方法的关键是采用三羟基丙腈作为筛选压カ和氮源，所述方法包括下述步骤(I)活化步骤，将经水洗后的固体样品的水洗液或者液体样品于25°C 37°C放置 12 24小时；(2)初歩富集步骤，在活化步骤后向样品中添加1% 2%的含三羟基丙腈的选择性筛选液体培养基；(3)再富集步骤，取Iml经初步富集的样品接种到选择性筛选液体培养基中，在37°C继续富集培养12 24小时后，取50 200 μ I富集培养液涂布于选择性筛选培养基固体平板，经36 72小时获得单菌落；(4) Berthelot初筛步骤，将2. 5g氢氧化钠、18. 7g磷酸氢ニ钠和15. 9g磷酸钠溶于400mL水中，加入含250mg有效氯的次氯酸钠溶液；用水稀释，用磷酸或磷酸钠调节pH为11. 7，最后定容至500mL，得氢氧化钠与次氯酸钠复配液，即A液，将5. Og苯酚和O. 025g亚硝基铁氰化钠溶于450mL水中，用水稀释定容至500mL，制得苯酚与亚硝基铁氰化钠复配液，即B液，取菌体催化样品待测样I μ L，加入A液、B液各50 μ L以及100 μ L双蒸水，混合均匀，37°C恒温并震荡反应20min，测定612nm处吸光度；(5)高压液相复筛步骤使用仪器为Waters 2545HPLC(Milford, MA, USA)，色谱柱为Aminex HPX-87H(300mmX 7. 8mm，USA)。色谱条件为进样量为10 μ I，流动相为O. 005ΜH2SO4,流速为 O. 3 O. 5ml mirT1，柱温为 35。。，其中对所用的样品没有特别的限定，主要是含有有机质、适合微生物生长的样品。本专利技术的筛选方法中用到的样品包括，但不限于，土壌、有机污染物、水体样品，及其它富含微生物的样品，特别是取自垃圾场或废水处理厂周围的土壤样品。本专利技术的筛选方法可以从土壌、有机污染物、水体样品、及其它富含微生物的样品中通过活化、初歩富集、再富集后经过筛选培养基筛选获得单克隆菌株并经过显色高通量筛选和高压液相检测后获得生产底物广泛性的腈水解酶的菌株，具体地，所述方法包括下述步骤(I)水洗步骤上述土壌及其它有机污染物等固体样品要通过水洗，以提高其富集效率，水洗固液质量比为I : 5 I : 10 ;(2)初步活化步骤经水洗后的固体样品的水洗液或者液体样品于25°C 37°C放置12 24小时；(3)初歩富集步骤向活化后向样品中添加1% 2%的含三羟基丙腈的选择性液体筛选培养基；(4)再富集步骤取Iml经初步富集的样品接种到装有30 70ml选择性筛选液体培养基的三角瓶中；继续富集培养12 24小时后，取50 200 μ I富集培养液涂布于选择性筛选培养基固体平板，经36 72小时获得单菌落；(5)显色高通量筛选步骤将2. 5g氢氧化钠、18. 7g磷酸氢ニ钠和15. 9g磷酸钠溶于400mL水中，加入含250mg有效氯的次氯酸钠溶液；用水稀释，用磷酸或磷酸钠调节pH为11. 7，最后定容至500mL，得氢氧化钠与次氯酸钠复配液(以下简称A液)，将5. Og苯酚和O. 025g亚硝基铁氰化钠溶于450mL水中，用水稀释定容至500mL，制得苯酚与亚硝基铁氰化钠复配液(以下简称B液)，取菌体催化样品待测样I μ L，加入A液、B液各50 μ L以及100 μ L双蒸水，混合均匀，37°C恒温并震荡反应20min，测定612nm处吸光度，(6)高压液相检测步骤使用仪器为Waters 2545HPLC(Milford, MA, USA)，色谱柱为Aminex HPX-87H(300mmX 7. 8mm，USA)。色谱条件为进样量为10 μ I，流动相为O. 005ΜH2SO4,流速为 O. 3 O. 5ml mirT1，柱温为 35 °C ；(7)获得生产底物广泛性的腈水解酶的菌株， 其中，所述选择性筛选培养基的成分是葡萄糖3 7g/l，K2HPO4O. 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选生产底物广泛性的腈水解酶的菌株的方法，其特征在于采用三羟基丙腈作为筛选压力和氮源，将适合微生物生长的样品经过活化、初级富集、再富集后经过Berthelot初筛、高压液相复筛步骤后获得生产底物广泛性的腈水解酶的菌株，其中所述活化、初级富集、再富集后经过Berthelot初筛、高压液相复筛步骤如下 (1)活化步骤，将经水洗后的固体样品的水洗液或者液体样品于25°C 37°C放置12 24小时； (2)初步富集步骤，在活化步骤后向样品中添加I% 2%的含三羟基丙腈的选择性筛选液体培养基； (3)再富集步骤，取Iml经初步富集的样品接种到选择性筛选液体培养基中，在37°C继续富集培养12 24小时后，取50 200 μ L富集培养液涂布于选择性筛选培养基固体平板，经36 72小时获得单菌落； (4)Berthelot初筛步骤，将2.5g氢氧化钠、18. 7g磷酸氢二钠和15. 9g磷酸钠溶于400mL水中，加入含250mg有效氯的次氯酸钠溶液；用水稀释，用磷酸或磷酸钠调节pH为11. 7,最后定容至500mL,得氢氧化钠与次氯酸钠复配液，即A液,将5. Og苯酹和O. 025g亚硝基铁氰化钠溶于450mL水中，用水稀释定容至500mL，制得苯酚与亚硝基铁氰化钠复配液，即B液，取菌体催化样品...

【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，张海波，刘炜，徐鑫，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：