本发明专利技术涉及一种鸡坏死性肠炎（C型）灭活疫苗的生产方法。目前国内尚没有针对鸡坏死性肠炎的灭活疫苗，而针对其他动物的梭菌疾病灭活疫苗通常采用的是肉肝胃酶消化汤培养基，该培养基其主要成分牛肉和肝等，受动物品种、年龄、新鲜及消化程度的影响较大，造成培养基质量不稳定、批次间离散度大且制作过程繁琐，进而影响疫苗的质量，特别是疫苗的均一性。而本发明专利技术所提供的合成培养基，克服了以上的缺陷，是进行细菌高细胞密度培养的发展趋势，具有操作简便、质量稳定的优点，为高品质的鸡坏死性肠炎（C型）灭活疫苗生产提供了有力的保障。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种鸡坏死性肠炎(C型)灭活疫苗的生产方法。属于兽用生物制品制造领域。
技术介绍
鸡坏死性肠炎又称为梭状芽孢杆菌肠炎(Clostridial enteritis),菌群失衡症(dysbacteriosis)或小肠细菌生长过度症(SIB0)。是由产气荚膜梭菌(ClostridiumperfringenS)A型或C型引起的一种疾病，A型产气荚膜梭菌产生a毒素，C型产生a和3毒素，这两种毒素是引起坏死性肠炎的主要毒素。病死禽以肝肿大、肠道出血和肠黏膜有麸皮样坏死灶为特征，正常鸡群的发病率为I. 3% 37. 3%，无特定病原鸡群的发病率可高达 62% (王泽华，李灿恒.鸡坏死性肠炎的诊断与防治，中国禽业导刊，2002，19 (14):35-36)。目前国内尚没有针对鸡坏死性肠炎的疫苗，治疗该病主要采用抗生素。国内其他梭菌类疫苗生产采用的是肉肝胃酶消化汤培养基，该培养基其主要成分牛肉和肝等，受动物品种、年龄、新鲜及消化程度的影响较大，造成培养基质量不稳定、批次间离散度大且制作过程繁琐，进而影响疫苗的质量，特别是疫苗的均一性。大规模发酵用合成培养基按照产气荚膜梭菌营养代谢特点设计，添加了促进菌体增殖、提高保护性抗原含量的生长因子，具有产毒量高、质量稳定、操作简便等优点。合成培养基是细菌疫苗质量好坏的关键因素，有鉴于此，本专利技术旨在设计一种适合C型产气荚膜梭菌CVCC60102株生长、产毒量高、成分相对确定、易于在线检测、监控和及时调整的合成培养基，制备C型产气荚膜梭菌灭活疫苗。
技术实现思路
将C型产气荚膜梭菌CVCC 60102株种子液按培养基总量的体积比1% 2%接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37°C厌氧培养/或静置培养培养18小时，培养结束后经3000r/min离心30min，去除菌体，分别用8Ku截留分子量的超滤浓缩系统进行超滤浓缩，经0. 6%的甲醛溶液灭活脱毒完全后，加入终浓度20%的氢氧化铝胶配制成疫苗。本专利技术详细描述I.疫苗生产用菌种(I)来源产气荚膜梭菌CVCC60102株菌种，原C59-2，5_2，由中国兽医药品监察所鉴定、保管和供应。该菌是1953年分离自内蒙古自治区呼纳盟新巴右旗的猝狙羊心血，强毒株。(2)菌种特性毒力肉肝胃酶消化汤培养物上清静脉注射，0. OOlml致死小白鼠；0. 05ml致死家兔，0. 5ml可致死绵羊。免疫原性1. Oml铝胶苗免疫家兔可产生75% 100%保护。2培养基采用本专利技术设计的合成培养基(I)配方如下蛋白胨3g，酵母粉0. 3g，氯化钠0. 25g，磷酸氢二钾0. 45g，葡萄糖0. 5g，亚硫酸钠0. 2g,半胱氨酸盐酸盐0. 05g,糊精lg, VcO. OOlg,去离子水加至IOOmlo(2)合成培养基配制方法按配方称取各成分溶于去注射用水中，用2mol/L的氢氧化钠调节pH值至8. 0 8.4。116°C高压灭菌 30min。 (3)合成培养基检验I)性状溶液澄清透明、呈棕色。2)无菌检验按中华人民共和国兽药典(中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇版三部.中国农业出版社，2011，以下称《中国兽药典》)规定的方法进行，应无菌生长。3) pH 值应为 8. 0 8. 4。4)生长试验⑴种子液制备将C型产气荚膜梭菌CVCC 60102株(中国兽医药品监察所提供)冻干菌种用Iml普通肉汤(中国兽医药品监察所提供)稀释后，接种于IOml肉肝胃酶消化汤中，置37°C培养18 24小时，同时分别接种普通肉汤、普通琼脂斜面、厌气肉肝汤和石蕊牛奶各2管，每管0. 2ml，培养48小时，纯粹检验合格后作为一级种子。在2 8°C保存，使用期不得超过15日。取一级种子0. Iml接种IOml肉肝胃酶消化汤，37°C培养18小时，纯粹检查合格后作为二级种子(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇〇〇年版.化学工业出版社，2001，以下称《规程》)。⑵菌液培养及判定将种子液按培养基总量体积比的1%接种到装有200ml液体培养基的500ml三角瓶内，37°C静置培养18小时，同时设I个不接种阴性对照。分别取样3000r/min离心30min，取上清按现行《规程》进行毒力测定(见附注)。毒力应达到500MLD/ml，且阴性对照应无菌生长。5)贮藏与有效期液体培养基应现配现用，高压灭菌后放置室温即刻使用。3疫苗制造(I)种子液制备将C型产气荚膜梭菌CVCC 60102株(中国兽医药品监察所提供)冻干菌种用Iml普通肉汤(中国兽医药品监察所提供)稀释后，接种于IOml肉肝胃酶消化汤中，置37°C培养18 24小时，同时分别接种普通肉汤、普通琼脂斜面、厌气肉肝汤和石蕊牛奶各2管，每管0. 2ml，培养48小时，纯粹检验合格后作为一级种子。在2 8°C保存，使用期不得超过15日。取一级种子0. Iml接种IOml肉肝胃酶消化汤，37°C培养18小时，纯粹检查合格后作为二级种子(中华人民共和国农业部.中华人民共和国兽用生物制品规程二〇〇〇年版.化学工业出版社，2001，以下称《规程》)。(2)疫苗制造将种子液按培养基总量体积比的1%接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37°C厌氧培养/或静置培养18小时。培养结束后菌液3000r/min离心30min，取上清经8Ku截留分子量的超滤浓缩系统浓缩后，立即加入0. 6%的甲醛溶液灭活脱毒4 6日，灭活脱毒完全后加入终浓度20%的氢氧化铝胶和0. 006%硫柳汞制成灭活疫苗。(3)成品检验性状本品静置后，上层为黄褐色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后成均匀混悬液。无菌检验按现行《中国兽药典》附注进行，应无菌生长。安全检验皮下接种14日龄的肉鸡10只，每只2ml，观察10日，不应出现由疫苗引起的任何局部和全身不良反应。 效力检验皮下注射14日龄的肉鸡5只，每只0. 5ml, 14日后,连同条件相同的对照肉鸡5只，各静脉注射0. 2ml(含1MLD)C型产气荚膜梭菌毒素，观察5日，免疫组至少4/5保护，不免疫对照组鸡5/5死亡。甲醛、硫柳汞含量测定按现行《中国兽药典》附录进行，制品中甲醛残留含量应不超过0. 5%，硫柳汞残留含量应不超过0. 01%。本专利技术涉及微生物的信息本专利技术涉及的C型产气荚膜梭菌CVCC60102株，来自中国兽医药品监察所中国兽医微生物保藏管理中心(中国兽医药品监察所中国兽医微生物保藏管理中心编著.中国兽医菌种目录第二版.中国农业科学技术出版社，2002)。本专利技术的积极意义目前国内尚无鸡坏死性肠炎灭活疫苗，而其他梭菌类疫苗通常采用的是肉肝胃酶消化汤或厌气肉肝汤培养基，该培养基其主要成分牛肉和肝等，受动物品种、年龄、新鲜及消化程度的影响较大，造成培养基质量不稳定、批次间离散度大且制作过程繁琐，进而影响疫苗的质量，特别是疫苗的均一性。而本专利技术所提供的合成培养基，克服了以上的缺陷，是进行细菌高细胞密度培养的发展趋势，具有操作简便、质量稳定的优点，为高品质的鸡坏死性肠炎灭活疫苗生产提供了有力的保障。具体实施例方式实施例I疫苗制造和检验(I)种子液制备将C型产气荚膜梭菌CVCC 60102株(中国兽医药品监察所提供)冻干菌种用Im本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种鸡坏死性肠炎(C型)灭活疫苗的生产方法，其特征在于将C型产气荚膜梭菌 CVCC60102株种子液按培养基总量的体积比1% 2%接种于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉为主要原材料的液体合成培养基中，37°C厌氧培养/或静置培养培养18小时，培养结束后经 3000r/min离心30min,去除菌体,分别用8Ku截留分子量的millipore超滤浓缩系统进行超滤浓缩，经O. 6%的甲醛溶液灭...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱良全，李聪研，蒋玉文，田冬青，孙晔，
申请(专利权)人：北京中海生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。