本发明专利技术公开了一种在Ti表面固定载VEGF的肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒的方法。首先利用Hep与PLL可发生静电交互作用形成纳米颗粒的特性，将载有VEGF的Hep与PLL进行混合，形成载VEGF的纳米颗粒。然后在Ti材料表面制备DM涂层，利用DM与伯氨基可发生麦克尔加成和西弗碱反应的特性，将含有氨基的纳米颗粒共价固定至样品表面，从而构建具有抗凝/促内皮双功能的生物化修饰表面。本发明专利技术在Ti表面构建具有抗凝血和再内皮化特性的纳米颗粒修饰层，显著改善了材料的血液相容性和内皮损伤修复能力。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及纳米颗粒制备技术和无机材料表面改性技术，特别涉及人工器官材料钛表面的生物化改性方法。
技术介绍
钛(Ti)基金属材料因其良好的生物相容性已广泛应用于生 物医学领域，但对于一些特殊应用的领域，如作为心血管植入材料用于心血管疾病的治疗，其生物相容性还远未达到临床要求。这主要是由于钛材料血液相容性较差，且对于血管内膜增生及炎症反应等并无抑制作用。通过对材料表面进行生物化改性，赋予材料良好的抗凝血能力和再内皮化能力是改善其生物相容性的有效方法。肝素Ofep)是一种临床常见的抗凝血药物，且肝素可与多种内皮细胞相关的生物因子结合，延长生物因子在体内的半衰期，促进内皮损伤修复。此夕卜，也有研究报道肝素在炎症的预防和治疗中也具有良好的效果。VEGF(血管内皮生长因子)是一种血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，对于血管内皮细胞的增殖迁移以及内皮祖细胞的动员、归巢及向内皮细胞的分化均起着重要作用。多巴胺(DM)是一种生物体内的神经传导物质，在溶液条件下可发生自聚反应。DM发生自聚的同时，部分儿茶酚基团可与金属或金属氧化物形成配位结合，从而在材料表面沉积一层聚DM层。得到的聚DM层具有二次反应性，其氧化得到的邻二琨基团能够与伯氨基(-NH2)、仲胺基(-NH)发生西弗碱反应或麦克尔加成反应。Hep与多聚赖氨酸(PLL)可通过静电交互作用组装成纳米颗粒，利用VEGF与肝素间的相互作用可将VEGF装载于颗粒中，形成载VEGF的Hep/PLL纳米颗粒。该种颗粒在材料表面的固定可有效改善材料的血液相容性，促进内皮损伤修复。而目前尚无将载VEGF的Hep/PLL纳米颗粒固定于钛材料表面的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种载VEGF的H印/PLL纳米颗粒的制备方法及其在Ti材料表面的固定方法，通过该方法对Ti材料表面进行生物化改性可有效提高材料的血液相容性和细胞相容性。本专利技术实现以上目的采用的技术方案是，，其步骤为A、样品制备。在抛光的纯Ti表面沉积聚多巴胺涂层,待用；B、载VEGF的Ifep/PLL纳米颗粒的制备。将浓度为50_500ng/ml的VEGF溶液(PBS，pH 7.4)等体积滴加至浓度为5-20mg/ml的肝素溶液(PBS，pH 7.4)中，37°C静置l_3h。然后在室温和磁力搅拌条件下，将Ifep和VEGF混合液等体积滴加至浓度为0. 2-lmg/ml的PLL (MW 15-30 万)溶液(PBS, pH 7. 4)中;C、纳米颗粒固定。将A步骤中沉积有DM的Ti片浸泡于B步获得的纳米颗粒悬液中，在15-50°C振荡条件下反应6-24小时，分别用PBS和双蒸水漂洗，干燥后即得目标物。本专利技术的反应过程与机理主要分为两个部分。第一部分为载VEGF的Hep/PLL纳米颗粒的制备。首先通过Ifep与VEGF的相互作用使VEGF与Ifep结合；其次在pH = 7. 4的PBS体系中，载有VEGF的Hep溶液与呈正电性的PLL溶液进行混合后可发生静电交互作用，通过分子间静电结合及分子缠绕作用，即可形成具有纳米尺寸的载VEGF的H印/PLL纳米颗粒。第二部分为纳米颗粒在Ti材料表面的固定。首先将Ti浸泡于DM的Tris溶液中，DM中的儿茶酚基团与Ti可形成配位结合，并在有氧条件下交联聚合，从而在Ti表面形成一层牢固的DM层。得到的DM聚合层具有二次反应性，其氧化得到的邻二琨基团可与DM中的伯氨基(-NH2)发生麦克尔加成反应和西弗碱反应，从而形成多层聚DM层；其次，纳米颗粒中PLL上的氨基也可与聚DM层表面的邻二琨结构发生麦克尔加成和西弗碱反应，从而将纳米颗粒共价固定在Ti表面。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是 一、创造性的制备出载VEGF的H印/PLL纳米颗粒，利用聚DM层能与伯氨基发生麦克尔加成和西弗碱反应的特性，可将富含氨基的纳米颗粒共价固定在DM涂覆的Ti表面。通过该种方法，可以有效提高VEGF的装载量，延长VEGF的半衰期，增强其内皮损伤修复效果。同时也可增强肝素及VEGF与材料的结合强度，降低药物损失率，延长药物作用时间。二、纳米颗粒的制备工艺及固定方法均简单易操作，无需昂贵复杂的设备，工艺成本较低，效果显著。三、纳米颗粒在材料表面的固定采用浸泡方式进行，可保证材料各个部分能均匀的固定上纳米颗粒，也有利于实现各种结构复杂的心血管植入设备如人工心脏瓣膜、血管支架等表面的纳米颗粒固定修饰，适用范围广。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术的方法作进一步详细的说明。图I为本专利技术方法中纳米颗粒制备及在Ti表面固定的各步骤示意图。图2为纳米颗粒粒径尺寸分布图。图3为样品表面血小板粘附的扫描电镜图。(a)Ti ； (b)固定纳米颗粒的Ti。图4为样品浸泡于PBS中后肝素的动态释放情况及释放前后样品表面抗凝性能检测。(a)Hep释放量；(b)样品表面活化部分凝血酶时间(APTT)测定结果。图5为样品表面内皮祖细胞培养后荧光染色结果。(a)Ti ；(b)固定纳米颗粒的Ti。具体实施例方式实施例一参见图1，本专利技术的第一种具体实施方式是，，其步骤为A、样品制备。在抛光的纯Ti表面沉积聚多巴胺涂层,待用；B、载VEGF的H印/PLL纳米颗粒的制备。将浓度为500ng/ml的VEGF溶液(PBS，pH7.4)等体积滴加至浓度为20mg/ml的肝素溶液(PBS，pH 7. 4)中，37°C静置lh。然后在室温和磁力搅拌条件下，将Ifep和VEGF混合液等体积滴加至浓度为lmg/ml的PLL (MW 15-30万)溶液(PBS, pH 7. 4)中;C、纳米颗粒固定。将A步骤中沉积有DM的Ti片浸泡于B步获得的纳米颗粒悬液中，在15-50°C振荡条件下反应24小时，分别用PBS和双蒸水漂洗，干燥后即得目标物。实施例二，其步骤为A、样品制备。在抛光的纯Ti表面沉积聚多巴胺涂层,待用；B、载VEGF的H印/PLL纳米颗粒的制备。将浓度为50ng/ml的VEGF溶液(PBS，pH7.4)等体积滴加至浓度为5mg/ml的肝素溶液(PBS，pH 7.4)中，37°C静置2h。然后在室温和磁力搅拌条件下，将Ifep和VEGF混合液等体积滴加至浓度为0. 2mg/ml的PLL (MW 15-30万)溶液(PBS, pH 7. 4)中;C、纳米颗粒固定。将A步骤中沉积有DM的Ti片浸泡于B步获得的纳米颗粒悬液中，在50°C振荡条件下反应6小时，分别用PBS和双蒸水漂洗，干燥后即得目标物。实施例三，其步骤为A、样品制备。在抛光的纯Ti表面沉积聚多巴胺涂层,待用；B、载VEGF的Ifep/PLL纳米颗粒的制备。将浓度为200ng/ml的VEGF溶液(PBS，PH 7.4)等体积滴加至浓度为10mg/ml的肝素溶液(PBS，pH 7.4)中，37°C静置3h。然后在室温和磁力搅拌条件下，将Hep和VEGF混合液等体积滴加至浓度为0. 5mg/ml的PLL (MW15-30 万)溶液(PBS, pH 7. 4)中;C、纳米颗粒固定。将A步骤中沉积有DM的Ti片浸泡于B步骤获得的纳米颗粒悬液中，在37°C振荡条件下反应12h，分别用PBS和双蒸水漂洗，干燥后即得目标物。本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种在Ti表面固定载VEGF的肝素/多聚赖氨酸纳米颗粒的方法，其步骤为 A、在抛光的纯Ti表面沉积聚多巴胺涂层，待用； B、载VEGF的Ifep/PLL纳米颗粒的制备将浓度为50-500ng/ml的VEGF溶液，等体积滴加至浓度为5-20mg/ml的肝素溶液中，37°C静置l_3h ;然后在室温和磁力搅拌条件下，将Hep和VEGF混合液等体积滴加至浓度为0. 2-l...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈俊英，刘涛，黄楠，刘诗卉，刘阳，陈圆，张琨，陈佳龙，冷永祥，赵元聪，
申请(专利权)人：西南交通大学，
类型：发明
国别省市：
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