一种反义寡核苷酸制造技术

本发明专利技术提供了一种反义寡核苷酸。在本发明专利技术中提供了使用外显子-居间AON来优化外显子跳跃的手段和方法。我们证实了通过靶向外显子中的推断的剪接调控序列(ESE)可提高跳跃效率。这种双重靶向对于在本发明专利技术之前难以获得有效跳跃的外显子是特别有益的。本发明专利技术还提供了表达所述反义寡核苷酸的载体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及寡核苷酸及其等同物以及将它们用于诱导外显子从mRNA中去除的应用。
技术介绍
近年来，反义技术已经得到相当大的发展。反义技术的一般领域可分为若干方面。这些方面之一是外显子跳跃领域。在该领域中，向细胞中加入小分子从而特异地干扰信使RNA(mRNA)的剪接，并且更具体地，干扰成熟的mRNA中的特定外显子的结合，或者更准确地说是成熟的mRNA中的特定外显子结合不足。在外显子跳跃领域中，可以区分为两种一般方法。一种方法集中在干扰剪接(即，外显子序列的物理连接)的酶促过程。另一种方法依赖于干扰剪接过程的逻辑学(logistics)，即干扰通过剪接机制对外显子的识别。两种方法均使用小分子来获得所需的效果。该小分子都共有核酸分子能够杂交至互补序列的特性。这样的小分子的实例当然是RNA和DNA、以及修饰的RNA和DNA (如LNA和吗啉代化合物(morpholinos)、以及诸如PNA的核酸模拟物)。这些分子进一步被称为通用术语小分子或更加经常使用的术语反义寡核苷酸(AON)。小分子被认为是通过杂交至pre-mRNA(前体mRNA)的特定位点而发挥作用的。杂交被认为干扰剪接的酶促过程或者外显子的识别。目前，外显子跳跃集中在将一种或多种外显子从成熟的mRNA中特异性去除。然而，使剪接机制改变方向从而将其他的外显子包括在mRNA中也是可能的。例如，这种方法可应用在进行选择性剪接的基因中。在这些情形下，可将小分子设计为使剪接机制改变方向，以便更加有效地形成具体的可选择方案(specific alternative)。
技术实现思路
本专利技术提供一种反义寡核苷酸(AON)，包括表2中示出的序列或者由表2中示出的序列组成。根据本专利技术的A0N，在一种实施方式中，包括14-40个核苷酸或其类似物。根据本专利技术的AON,在一种实施方式中，包括14-25个核苷酸或其类似物。根据本专利技术的A0N，在一种实施方式中，所述AON包括SEQ ID N0:118表示的h44A0N4 或者由 SEQ ID NO :118 表示的 h44A0N4 组成。根据本专利技术的A0N，在一种实施方式中，所述AON是修饰的寡核苷酸。根据本专利技术的A0N，在一种实施方式中，所述AON包括至少一个核苷酸类似物。根据本专利技术的A0N，在一种实施方式中，所述AON包括选自2' _0_甲基核糖核苷酸、硫代膦酸酯骨架、吗啉代核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、和/或乙撑桥联核酸(ENA)核苷酸中的一种或多种修饰。根据本专利技术的A0N，在一种实施方式中，所述AON包括一个或多个2' _0_甲基寡核糖核苷酸、硫代膦酸酯骨架、吗啉代寡核苷酸、锁核酸(LNA)寡核苷酸、和/或乙撑桥联核酸(ENA)寡核苷酸。根据本专利技术的A0N，在一种实施方式中，所述AON包括吗啉代磷酰二胺寡核苷酸。根据本专利技术的A0N，在一种实施方式中，所述AON包括一个或多个2' _0_甲基硫代膦酸酯核苷酸。根据本专利技术的A0N，在一种实施方式中，所述AON包括一个或多个2' _0_甲基硫代膦酸酯寡核苷酸。根据本专利技术的A0N，在一种实施方式中，包括全长硫代膦酸酯骨架，且其中，所有核苷酸包括2' -0-甲基修饰。根据本专利技术的AON,在一种实施方式中，少于10%的核苷酸是核苷酸类似物。 本专利技术还提供了一种载体，表达上述AON或其前体。根据本专利技术的载体，在一种实施方式中，其为病毒载体。根据本专利技术的载体，在一种实施方式中，其为腺相关病毒载体。在本专利技术中，已经发现外显子跳跃过程能够变得更加有效。许多关于外显子跳跃的早期研究是使用针对抗肌萎缩蛋白基因中外显子跳跃的AON而进行的。迄今为止，我们已经识别了一系列的114个外显子-居间AON (exon-internal AON),它们在培养的肌细胞中诱导35个外显子的跳跃(14)。我们的数据表明，有效的外显子-居间AON可能是通过对富含丝氨酸/精氨酸的(SR)蛋白家族成员结合至外显子剪接增强子(ESE)位点的空间位阻而发挥作用的(15)。SR蛋白结合至外显子序列移动(exon sequence motive)并集结其他的剪接因子以介导剪接作用(19)。对于我们所研究的多数外显子而言，单个ESE的AON-靶向(AON-targeting)足以诱导显著水平的外显子跳跃(14)。然而，对于一些外显子而言，跳跃效率低至O。在本专利技术中，我们证实了通过用两个或多个外显子居间AON来靶向外显子可以提高跳跃水平。为此目的，本专利技术提供了一种用于确定在产生含所述mRNA前体的外显子的细胞中是否能提高从成熟的mRNA中去除外显子的效率的方法，所述方法包括为所述细胞提供能够杂交至所述外显子的外显子居间部分的第一反义寡核苷酸(AON)，并在为所述细胞提供能够杂交至所述外显子的另一外显子居间部分的第二 AON后，确定所述效率是否得到提高。优选通过与每一种单独AON的效率比较水平来确定效率的提高。本文使用的术语提高的效率是指这样的情形，其中⑴去除了靶标外显子的mRNA的量高于每一种单独A0N，或(ii)在所述细胞中能够检测靶标外显子的去除的时间间隔增力口，或(iii) 二者的结合。与使用单个AON的外显子跳跃方法相比，本专利技术的方法还提供了额外的稳健性。因此，本专利技术进一步提供了一种用于在由细胞产生的pre-mRNA中诱导外显 子跳跃的方法，该方法包括为所述细胞提供至少两个能够杂交至所述pre-mRNA上外显子的不同外显子居间部分的A0N，并培养所述细胞以允许所述pre-mRNA进行剪接。—种序列由于其终止于成熟mRNA中的pre-mRNA的一部分，因而通常被称为外显子。pre-mRNA包含至少一个内含子。第一个外显子包含帽子-位点而最后一个外显子通常包含poly A信号。在本专利技术中，外显子跳跃优先定向于居间外显子。居间外显子是外显子2至外显子n-1中的任一个，其中n是所述pre-mRNA中的外显子总数。当外显子跳跃时，其就不再包括在成熟mRNA中。这种特征可被一些人看作是，预示着该序列不再是外显子而是内含子(或内含子的一部分)。因此，在本文中将外显子限定为存在于pre-mRNA中的序列，在不为细胞提供诱导所述外显子跳跃的AON时，其通过表达所述pre-mRNA的细胞的剪接机制而结合至成熟的mRNA中。因此，本专利技术中的外显子跳跃方法也被认为是用于将外显子序列改变为内含子序列的方法，可替换地，本专利技术的方法是一种用于掩蔽(masking)外显子序列的方法，因而当外显子序列被掩蔽时，所述外显子序列不再被细胞的剪接机制识别为外显子。可以以多种不同的方式来为细胞提供AON。在一种优选的实施方式中，通过将所述AON结合至基因递呈载体(优选脂质体)中从而将所述AON提供至所述细胞中。在另一种优选的实施方式中，通过表达所述AON或其前体的载体的方式将所述AON提供至所述细胞中。在一种优选的实施方式中，所述载体包括病毒载体、优选腺相关病毒载体。因此，本专利技术进一步提供一种基因递呈载体，包括至少两个对相同外显子特异的外显子居间AON。 使用至少两个对相同外显子特异的外显子居间AON使得本专利技术的方法更加强有力。此外，其使得当仅使用一个AON时不能有效跳跃的外显子有效跳跃。不受理论的限制，可以认为外显子-居间AON通过阻遏结合至外显子本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2006.05.19 EP 06076078.21.一种反义寡核苷酸(AON),包括表2中示出的序列或者由表2中示出的序列组成。2.根据权利要求I所述的Α0Ν，包括14-40个核苷酸或其类似物。3.根据权利要求2所述的Α0Ν，包括14-25个核苷酸或其类似物。4.根据权利要求I至3中任一项所述的Α0Ν，其中，所述AON包括SEQID NO :118表示的h44A0N4或者由SEQ ID NO :118表示的h44A0N4组成。5.根据权利要求I至3中任一项所述的Α0Ν，其中，所述AON是修饰的寡核苷酸。6.根据权利要求I至3中任一项所述的Α0Ν，其中，所述AON包括至少ー个核苷酸类似物。7.根据权利要求5所述的Α0Ν，其中，所述AON包括选自2'-O-甲基核糖核苷酸、硫代膦酸酯骨架、吗啉代核苷酸、锁核酸(LNA)核苷酸、和/或こ撑桥联核酸(ENA)核苷酸中的ー种或...

【专利技术属性】
技术研发人员：安内米克·阿尔特斯马鲁斯，朱迪思·克里斯蒂娜·西奥多拉·范多伊特科姆，加里让·布德韦恩·范奥姆门，
申请(专利权)人：莱顿教学医院，
类型：发明
国别省市：