本发明专利技术公开一种单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria?monocytogenes）核酸标准样品、其建立方法及应用，其通过菌株培养、鉴定、核酸标准样品的制备、核酸标准样品的干燥、均匀性和稳定性检查、定性检定、核酸标准样品定值等项工作,获得一种单核细胞增生李斯特氏菌（Listeria?monocytogenes）核酸标准样品。本发明专利技术解决了国内食品中致病菌核酸标准样品紧缺的状况，对解决食品中致病菌核酸标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌分子生物学检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义，并对开展食品中致病菌分子生物学检测工作，食品致病菌核酸标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品检测
，具体涉及单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品制备、其建立方法及其在检测单核细胞增生李斯特氏菌中的应用。
技术介绍
食品安全是重大公共卫生问题，是制约我国经济发展的重要因素。而微生物污染造成的食源性疾病，是我国食品安全中最突出的问题。近年来，随着食品产业结构的调整、经济全球化与国际贸易的迅速发展，我国食源性疾病的防控面临一系列新问题和挑战。 食品中微生物引起食源性疾病的预防与控制已引起了世界各国关注，食品中微生物的检测技术是预防与控制的关健的技术环节。目前我国食品中微生物的检测仍以传统的病原菌培养、血清抗体检测、和生化特征比较水平为主，不能满足日益发展的检验检疫工作的需要。常规分离培养耗时长，灵敏度低，某些微生物的培养极为困难。随着2007年《食品中致病菌检测方法——实时PCR法》(SN/T1870-2007)和《食品中多种致病菌快速检测方法——PCR法》(SN/T1869-2007)两项检验检疫行业标准的发布实施，以及即将发布实施的《食品中致病菌检测方法一DHPLC法》等系列分子生物学检测国家标准和行业标准。简单快速，灵敏度高的PCR、实时荧光PCR技术，正在食品致病菌检测领域开始发挥重要作用。由于食品中细菌的特殊性，人们很难获得细菌分子生物学检测阳性样品，加之食品中致病菌分子生物学检测技术的研究刚刚起步，而配套的标准样品的研究工作则起步较晚，制备技术复杂，样品定值和不确定度的评估存在很多困难，因而国内外食品致病菌核酸标准样品(定量、定性测试)基本上是一片空白。目前国内外没有适用于食品中致病菌分子生物学检测用核酸标准样品，仅有成套分子生物学检测试剂盒中配备的阳性对照品，价格非常昂贵，也不具备核酸标准样品的效能，不能适时地满足检验检疫工作的需要。研究制备新型的食品致病菌核酸标准样品，对于保证灵敏、特异、快速检测食品中致病菌，具有十分重要的意义。为了解决食品中致病菌核酸标准样品目前国内外均处于空白状况，本项目主要针对食品中致病菌核酸定性和定量检测项目，研究制备食品中单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品。通过对致病菌核酸标准样品的关键制备技术和保存技术的研究，并进行定值技术和定值方式的研究，开展均匀性和稳定性研究，并对食品中致病菌核酸标准样品的不确定度进行深入细致的研究，最终研制出具有较好的均匀性和稳定性的单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)核酸标准样品。开发处于世界领先水平，具有我国自主知识产权的食品中致病菌核酸标准样品制备技术；满足食品安全检测的需求，满足国内外食品微生物检测实验室的需求。
技术实现思路
鉴于食品中致病菌单核细胞增生李斯特氏菌核酸标准样品紧缺的状况，根据实际工作的需要和国内现状开展了食品中致病菌核酸标准样品的研制。本项标准样品的制备完成，对全面深入的研究解决食品中致病菌核酸标准样品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌分子生物学检测标准样品的研制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。加之人们对食品安全方面的关注和重视，以及开展食品中致病菌分子生物学检测工作的日益扩展和重要性，标准样品又是实验室质量控制工作的重要环节，食品致病菌核酸标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益和社会效益。本专利技术所采用的技术方案是单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes) ATCC :7644的菌株培养、鉴定、核酸标准样品的制备、核酸标准样品的干燥、均匀性和稳定性检查、定性检定、核酸标准样品定值等项工作。取制备的核酸标准样品，经采用实时PCR方法和PCR方法定性分析，确认所制备的核酸标准样品为单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC :7644 核酸样品。米用 PicoGreen DNA 分子突光定量方法及紫外分光光度法，随机抽取样品进行测试，数据进行T检验和F检验确认样品均勻性。经Grubbs检验和Cochran检验,所有数据均可作为定值依据；经正态性检验,这些数据符合正态分布。制备的核酸样品经过了四年的稳定性测定，在避光、密封，_20°C以下温度 贮存，四年内稳定。本专利技术的一方面在于一种单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)标准样品，其特征在于制备方法的具体步骤如下(一)基因组核酸的提取①单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC :7644经菌株活化、增菌培养；②将步骤①获得的增菌培养液于4000g，4°C离心15min ；③吸弃上清，取沉淀I 3mL，加pH8. 0的TE溶液IOmL悬浮，加0. 5mL浓度为IOOg/L SDS和50 ii L浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37°C温浴Ih ；④加2mL浓度为5mol/L NaCl，混匀，加I. 5mL CTAB-NaCl混合溶液，混匀，65°C温浴 20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液为 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ；⑤取上清，加与上清等体积的酚-氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心IOmin ；其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚氯仿异戊醇的体积比为25 24 I ；⑥取上清，加与上清等体积的氯仿-异戊醇混合液，混匀，6000g离心IOmin ;其中，氯仿-异戊醇混合液中氯仿异戊醇的体积比为24 I ；⑦取上清，加上清0. 6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心IOmin ；⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mLpH8. 0的TE溶液溶解，获得单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC :7644基因组核酸溶液；⑨紫外分光光度计测步骤⑧所得产物的260nm和280nm处的光密度值，当OD26tl/OD280比值在I. 7 I. 9之间时，分装核酸样品并进行冷冻干燥；其中，上文所述pH8. 0的TE缓冲液组成10mM Tris-HCl, ImM EDTA (乙二胺四乙酸)配制500ml 的 pH8. 0 的 TE 缓冲液的方法量取 5ml IM Tris-HCl PH=8. 0 和 Iml0. 5MEDTA PH=8. 0的溶液于500ml烧杯中，向烧杯中加入约400ml蒸馏水均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存。(二)冷冻干燥①样品预冻先把步骤I所得的核酸样品溶液在_80°C低温冷冻2h ；②冷冻过程置干燥室制冷，温度降至_35°C时开启冷却阱制冷；冷却阱制冷温度降至-40°C时，将预冻的核酸样品迅速放入干燥室内，关好干燥室门；启动真空泵开始抽真空；待真空度降至0. 5Torr时，结束冷冻过程；③样品干燥干燥室温度设置为15°C，当真空度降至0. ITorr时，关闭真空泵，取出样品，迅速旋紧瓶盖获得单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC 7644基因组核酸标准样品，置于_20°C中避光贮存。本专利技术的另一方面在于公开一种用于非疾病诊断目的的单核细胞增生李斯特氏菌的Real-Time PCR检测试剂盒，其包括单核细胞增生李本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)标准样品,其特征在于制备方法的具体步骤如下 I 基因组核酸的提取 ①单核细胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)ATCC :7644,经菌株活化、增菌培养； ②将步骤①获得的增菌培养液于4000g，4°C离心15min； ③吸弃上清，取沉淀I 3mL，加pH8.0的TE溶液IOmL悬浮，加0. 5mL浓度为100g/L SDS和50 ii L浓度为20mg/mL的蛋白酶K，混匀，37°C温浴Ih ； ④加2mL浓度为5mol/LNaCl，混匀，加I.5mLCTAB-NaCl混合溶液，混匀，65 °C温浴20min ;其中，CTAB-NaCl 混合溶液为 100g/L CTAB 和 0. 7mol/L NaCl ； ⑤取上清，加与上清等体积的酹-氯仿-异戍醇混合液，混勻，6000g离心IOmin;其中，酚-氯仿-异戊醇混合液中酚氯仿异戊醇的体积比为25 24 I ； ⑥取上清，加与上清等体积的氯仿-异戍醇混合液，混勻，6000g离心IOmin;其中，氯仿-异戊醇混合液中氯仿异戊醇的体积比为24 : I ; ⑦取上清，加上清0.6倍体积的异丙醇，混匀，13000g离心IOmin ； ⑧取沉淀，用70%乙醇清洗2次，干燥，加4mLpH8. 0的TE溶液溶解，获得单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes) ATCC :7644基因组核酸溶液； ⑨紫外分光光度计测步骤⑧所得产物的260nm和280nm处的光密度值，当0D26(l/0D28(l比值在I....
【专利技术属性】
技术研发人员：曹际娟，于兵，徐君怡，赵昕，
申请(专利权)人：曹际娟，于兵，徐君怡，赵昕，
类型：发明
国别省市：
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