一种新β-葡萄糖苷酶及其基因和在糖苷合成中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一种具有β-葡萄糖苷酶活性的新蛋白质，其编码核酸，包含该核酸的表达载体以及含有该核酸或表达载体的转化体。本发明专利技术还提供所述的具有β-葡萄糖苷酶活性的新蛋白质作为催化剂在催化单糖和醇进行逆水解反应形成糖苷中的应用。与传统的杏仁β-葡萄糖苷酶相比，本发明专利技术的β-葡萄糖苷酶热稳定性更好，且与许多其他微生物来源的β-葡萄糖苷酶相比能耐受更高浓度的葡萄糖，在糖苷的合成中具有很好的工业应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，具体涉及ー种新β-葡萄糖苷酶及其基因，含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该β-葡萄糖苷酶或其重组酶作为催化剂在逆水解合成糖苷化合物中的应用。
技术介绍
糖苷是糖基和糖基配体以共价键连接的ー类化合物的统称。很多糖苷化合物具有特殊的生物活性，担负着重要的生理功能；一些糖苷化合物，如红景天苷、熊果苷具有特定的药用价值；而烷基葡萄糖苷作为ー类新型緑色非离子表面活性剤，在洗涤剂、食品添加剂等领域中有着广泛的应用。与化学合成法相比，酶法合成糖苷无需使用重金属催化剂，反应条件温和，同时避免了繁琐的保护/去保护步骤，环境友好，格外受到青睐。由热力学控制 的逆水解反应和由动力学控制的转糖基反应是糖苷酶应用于糖苷合成的两种反应模式。与转糖基反应相比，逆水解反应可以直接接受单糖作为底物，反应体系简单，且由于反应生成的副产物是水，目标产物糖苷的分离提取比较简便。葡萄糖苷酶(P-Glucosidase，EC 3. 2. I. 21)是广泛存在于细菌、真菌、植物、以及动物体内的ー类水解酶。植物种子发芽期间，在糖苷酶的作用下会生成大量葡萄糖，因此植物来源的葡萄糖苷酶通常能够耐受高浓度的葡萄糖。商品化的杏仁葡萄糖苷酶被广泛应用于逆水解反应合成糖苷化合物，但其存在着不够稳定的缺陷，即使反应温度提高到50°C，逆水解反应仍需要很长的时间才能达到平衡(J. Mol. Catal. B-Enzym. 1996，1:165-172)。为了提高反应速率，需要挖掘稳定的葡萄糖苷酶，使得较高温度下的反应得以实现。近年来，许多嗜热微生物来源的β_葡萄糖苷酶陆续被分离表征，但多数微生物来源的β -葡萄糖苷酶的活性易受葡萄糖的抑制，因而限制了它们在逆水解反应合成糖苷中的应用。此外，即使是极端热稳定的β_葡萄糖苷酶，在高温下受反应体系中高浓度的有机溶剂和美拉德反应的影响，也易迅速丧失活性，如来源于极端嗜热菌Pyrococcusfuriosus的β-葡萄糖苷酶用于正己醇的糖化吋，由于酶的迅速失活，转化率只能达到2.64%，远远没有到达平衡状态(Enzyme Microb. Technol. 2001，29，621-624)。因此，针对糖苷化合物的逆水解合成，亟需筛选高效稳定的，耐受高浓度葡萄糖的β -葡萄糖苷酶，以满足エ业需要。Genbank收录了ー种β -葡萄糖苷酶DtGH (登录号为NCOl 1297)，其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所不,共包含445个氨基酸,它来源于Dictyoglomus thermophilum DSM 3960,其编码基因(Genbank登录号NCOl 1297，REGION :1647894. . . 1649231)的核苷酸序列如SEQID No. I所示，共包含1338个碱基。但至今尚未见该β -葡萄糖苷酶任何实际应用的文献报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，针对已报道的微生物来源的β -葡萄糖苷酶在生物催化合成烷基糖苷时不够稳定、易受高浓度葡萄糖抑制等问题，提供了一种催化活性高、热稳定好、对高浓度葡萄糖耐受性好、在低含水量体系中稳定、反应时间短的β -葡萄糖苷酶，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及其高效制备方法，以及该β-葡萄糖苷酶在催化糖苷合成中的应用。本专利技术通过下述技术方案以解决上述技术问题本专利技术的第一方面提供一种分离的蛋白质，其特征在于其是如下(a)或(b)的蛋白质(a)序列表中SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加ー个或几个氨基酸且具有β -葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列至少70%相同的蛋白质。SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质来源于Dictyoglomusthermophilum DSM 3960,具有β -葡萄糖苷酶的功能,是ー种新的β_葡萄糖苷酶。所述的SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质可以从Dictyoglomusthermophilum DSM 3960中分离获得,也可以从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，也可以人工合成获得。SEQ ID No. 2所示的β -葡萄糖苷酶和其他已知β _葡萄糖苷酶之间的同源性(即氨基酸序列相似性)见表I。本专利技术中氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示的β -葡萄糖苷酶与已知β -葡萄糖苷酶的氨基酸序列的同源性低于60%，具有显著差异性。表I.本专利技术的新葡萄糖苷酶和其他已知葡萄糖苷酶同源性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离的蛋白质，其特征在于其是如下(a)或(b)的蛋白质 (a)序列表中SEQID No. 2所不的氣基酸序列组成的蛋白质； (b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加ー个或几个氨基酸且具有葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列至少70%相同的蛋白质。2.一种分离的核酸，其特征在于其是如下(I)或(2)的核酸 (1)由序列表中SEQID No. I所示核苷酸序列组成的核酸； (2)编码如下蛋白质(a)或(b)的核酸 (a)由序列表中SEQID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加ー个或几个氨基酸且具有葡萄糖苷酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列至少70%相同的蛋白质。3.ー种包含如权利要求2所述的核酸的重组表达载体。4.ー种包含如权利要求3所述的重组表达载体的重组表达转化体。5.一种重组葡萄糖苷酶的制备方法，其特征在于，包括如下步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：郁惠蕾，邹争争，许建和，李春秀，潘江，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：