通过改进的A蛋白洗脱增强的蛋白质纯化制造技术

本发明专利技术提供用于纯化包含CH2/CH3区的多肽的方法，其包括使多肽与A蛋白结合，并用起始于低pH的pH梯度洗脱。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及用于纯化包含^/^区的多肽的方法，其包括使多肽与A蛋白结合，并用PH梯度洗脱。
技术介绍
蛋白质的大规模、经济纯化是生物技术产业越来越重要的问题。一般而言，使用通过插入包含该蛋白质的基因的重组质粒改造为产生目的蛋白质的哺乳动物或细菌细胞系，通过细胞培养产生蛋白质。由于所使用的细胞系是活生物，必须用包含糖、氨基酸和通常补充自动物血清制剂的生长因子的复合生长培养基饲养。从饲养细胞的化合物的混合物及从细胞自身的副产物分离希望的蛋白质至足以用作人用药物的纯度提出了艰巨的挑战。用于从细胞碎片纯化蛋白质的方法最初依赖于蛋白质的表达部位。可以使一些蛋白质直接从细胞分泌进入周围的生长培养基中；其他蛋白质在细胞内产生。对于后一类蛋白质，纯化方法的第一步涉及细胞的裂解，其可通过包括机械剪切、渗透压休克或酶处理的多种方法来进行。这种破裂使细胞的全部内含物释放入匀浆中，此外还产生由于其小尺寸而难以去除的亚细胞片段。一般通过差速离心或通过过滤来去除这些。虽然规模较小，但由于细胞在蛋白质产生过程中的自然死亡和胞内宿主细胞蛋白质的释放，直接分泌的蛋白质也产生了同样的问题。一旦获得了包含目的蛋白质的澄清溶液，即通常用不同层析技术的组合尝试从细胞产生的其他蛋白质分离它。通常将利用待纯化的蛋白质与固定化捕获剂之间的特异性相互作用的亲和层析用于一些蛋白质(例如用作人用药物的蛋白质)。A蛋白是用于包含Fe区的蛋白质，如抗体的亲和层析的有用吸附剂。A蛋白是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD的细胞壁蛋白质,其以高亲和力(对人IgG为约10-8M)与抗体的Fe区结合。但是，由于蛋白质趋于聚集或错折叠，希望的蛋白质(即单体)通常从这些亲和柱与其他杂质(如蛋白质聚集体、细胞自身的副产物(即宿主细胞杂质)或病毒滤器结垢物(virus filter foulant))共纯化。已发展了其他技术来基于它们的电荷、疏水程度或大小进一步分离这些杂质和蛋白质混合物，如离子交换层析、疏水作用层析或大小排阻层析。对于这些技术中的每一种，可获得几种不同的层析树脂或吸着剂，允许精确地使纯化方案适应所涉及的具体蛋白质。这些分离方法中的每一种的实质是可以使蛋白质以不同速率在长固相(例如柱)中向下移动，达到随它们进一步向下通过固相而增加的物理分离，或选择性附着至分离介质，然后通过不同溶剂差异洗脱。但是，这些方法中的每一种需要额外的缓冲液、树脂或吸着剂和其他资源进行进一步的纯化，这反过来导致更长的处理时间和更高的成本。因此，需要用于纯化蛋白质单体的更有效和经济的方法。美国专利申请号12/008，160中描述了用A蛋白柱从聚集体、多聚体和修饰蛋白质纯化多肽和用PH梯度洗脱系统洗脱的方法。本文中引用的所有出版物、专利和专利申请在此为了所有目的以相同的程度以其整体引入作为本文中的参考，就如同具体和单独地说明这样引入每一单个出版物、专利和专利申请作为参考一样。 专利技术概述本专利技术提供通过使多肽与A蛋白结合并用起始于低pH的pH梯度洗脱来纯化包含Ch2/Ch3区的多肽的方法。这些纯化方法提供了达到更好地从包括宿主细胞杂质、病毒滤器结垢物、病毒或病毒样颗粒、碱性多肽变体和多肽聚集体的多种杂质连续分离多肽或非聚 集体，以及希望的多肽单体在纯化级分/库(pool)中更高的纯度的优势。可以用多种A蛋白层析树脂和层析吸着剂来完成这些方法。还可以在制造规模和商业方法中使用这些方法，且可以便于除柱层析外的备选下游纯化技术的利用。在一方面，本专利技术提供用于纯化包含CH2/CH3区的多肽的方法，其包括使多肽与A蛋白结合，并用起始于5. O或5. O以下的pH梯度洗脱。在另一方面，本专利技术提供用于纯化包含CH2/CH3区的多肽的方法，其包括以下步骤(a)使多肽与A蛋白结合；和(b)用洗脱缓冲液以起始于5. O或5. O以下的pH梯度洗脱多肽，其中洗脱缓冲液包含高PH缓冲液和低pH缓冲液，且其中通过调节各pH缓冲液在洗脱缓冲液中的百分比来形成PH梯度。在一些实施方案中，pH梯度起始于约pH 4. 2。在其他实施方案中，pH梯度起始于约pH 4.3。在一些实施方案中，pH梯度起始于约4. 6。在一些实施方案中，pH梯度终止于3.O或3. O以上。在一些实施方案中，pH梯度终止于约3. 7。在一些实施方案中，高pH缓冲液为约pH 5.0，且其中低pH缓冲液为约pH 2.7。在一些实施方案中，低pH缓冲液的百分比起始于约35%。在一些实施方案中，含有约35%低pH缓冲液的洗脱缓冲液包含约16. 25mM乙酸盐和约8. 75mM甲酸盐。在其他实施方案中，低PH缓冲液的百分比起始于约25%。在一些实施方案中，含有约25 %低pH缓冲液的洗脱缓冲液包含约18. 75mM乙酸盐和约6. 25mM甲酸盐。在一些实施方案中，低pH缓冲液的百分比起始于约40%。在一些实施方案中，含有约40%低pH缓冲液的洗脱缓冲液包含约15mM乙酸盐和约IOmM甲酸盐。在一些实施方案中，以起始于约14g/L的上样密度上样多肽。在一些实施方案中，以从约14g/L至约45g/L的范围内的上样密度上样多肽。在一些实施方案中，A蛋白是A蛋白柱层析树脂或A蛋白层析吸着剂。在一些实施方案中，A蛋白层析吸着剂是膜或整料(monolith)。在一些实施方案中，A蛋白是A蛋白柱层析树脂，且其中多肽具有从约5个柱体积/小时至约25个柱体积/小时的范围内的洗脱流速。在一些实施方案中，A蛋白是A蛋白柱层析树脂，且其中多肽的纯化级分包含约或少于约12个A蛋白柱体积。在一些实施方案中，从多肽分离宿主细胞杂质。在一些实施方案中，宿主细胞杂质是中国仓鼠卵巢蛋白质(CHOP)。在一些实施方案中，从多肽分离聚集体。在其他实施方案中，从多肽分离病毒滤器结垢物。在一些实施方案中，从多肽分离病毒颗粒或病毒样颗粒。在其他实施方案中，从多肽分离碱性多肽变体。在一些实施方案中，Ch2/Ch3区包含免疫球蛋白的Fe区。在一些实施方案中，多肽是抗体。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或抗体片段。在其他实施方案中，多肽是免疫黏附素(immunoadhesion)。在一些实施方案中，多肽具有至少约98 %单体的纯度。在其他实施方案中，多肽具有至少约99%单体的纯度。在一些实施方案中，宿主细胞杂质与纯化的多肽的比值比未纯化的多肽中的比值低至少约75%、低约80%、低约85%、低约90%、低约95%、低约96%、低约97%、低约98%或低约99%。在一些实施方案中，宿主细胞杂质与纯化的多肽的比值比通过分级洗脱法纯化的多肽中的比值低至少约20%，其中分级洗脱法包括使多肽与A蛋白结合，并用起始于3. 6或3.6以下的pH洗脱。在一些实施方案中，宿主细胞杂质与纯化的多肽的比值比通过分级洗脱法纯化的多肽中的比值低至少约60%，其中分级洗脱法包括使多肽与A蛋白结合，并用起始于3. 6或3. 6以下的pH洗脱。在一些实施方案中，纯化的多肽具有少于约15000颗粒/ml的病毒颗粒或病毒样颗粒计数。在一些实施方案中，纯化的多肽具有少于约12500颗粒/ml、少于约10000颗粒/ml、少于约7500颗粒/ml、少于约5000颗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.09.01 US 61/238,867;2009.10.20 US 61/253,4381.用于纯化包含Ch2/Ch3区的多肽的方法，其包括使所述多肽与A蛋白结合，并用起始于5. O或5. O以下的pH梯度洗脱。2.权利要求I的方法，其中所述pH梯度起始于约pH4.2。3.权利要求I的方法，其中所述pH梯度起始于约pH4.3。4.权利要求I的方法，其中所述pH梯度起始于约pH4. 6。5.权利要求1-4中任ー项的方法，其中所述pH梯度终止于3.O或3. O以上。6.权利要求5的方法，其中所述pH梯度终止于约3.7。7.权利要求I的方法,其中从所述多肽分离了宿主细胞杂质。8.权利要求7的方法，其中所述宿主细胞杂质是中国仓鼠卵巣蛋白质(CHOP)。9.权利要求I的方法，其中从所述多肽分离了聚集体。10.权利要求I的方法，其中从所述多肽分离了病毒滤器结垢物。11.权利要求I的方法，其中从所述多肽分离了病毒颗粒或病毒样颗粒。12.权利要求I的方法，其中从所述多肽分离了碱性多肽变体。13.权利要求I的方法，其中所述Ch2/Ch3区包含免疫球蛋白的Fe区。14.权利要求I的方法，其中所述多肽是抗体。15.权利要求14的方法，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或抗体片段。16.权利要求I的方法，其中所述多肽是免疫黏附素。17.权利要求I的方法,其中所述纯化的多肽具有至少约98%单体的纯度。18.权利要求I的方法,其中所述纯化的多肽具有至少约99%单体的纯度。19.权利要求I的方法，其中宿主细胞杂质与纯化的多肽的比值比通过分级洗脱法纯化的多肽中的比值低至少约20%，其中所述分级洗脱法包括使所述多肽与A蛋白结合，并用起始于3. 6或3. 6以下的pH洗脱。20.权利要求I的方法，其中宿主细胞杂质与纯化的多肽的比值比通过分级洗脱法纯化的多肽中的比值低至少约60%，其中所述分级洗脱法包括使所述多肽与A蛋白结合，并用起始于3. 6或3. 6以下的pH洗脱。21.权利要求19或20的方法，其中所述纯化的多肽是多肽单体。22.权利要求I的方法，其中所述A蛋白是修饰或未修饰的A蛋白配体。23.权利要求I的方法，其中所述纯化是制造规模的方法。24.权利要求I的方法，其中所述A蛋白是A蛋白柱层析树脂或A蛋白层析吸着剂。25.权利要求24的方法，其中所述A蛋白层析吸着剂是膜或整料。26.权利要求24的方法，其中所述A蛋白是A蛋白柱层析树脂，且其中所述多肽的纯化级分包含约12个A蛋白柱体积或少于约12个A蛋白柱体积。27.权利要求I的方法，其进ー步包括对所述多肽进行病毒过滤步骤。28.权利要求I的方法，其进ー步包括对所述多肽进行离子交换层析步骤。29.权利要求28的方法，其中所述离子交換层析步骤在权利要求I的pH梯度纯化步骤后连续进行。30.权利要求I的方法，其中所述方法不包括进ー步的纯化步骤来去除聚集体。31.权利要求I的方法，其中所述方法不包括进ー步的纯化步骤来去除病毒滤器结垢物。32.用于纯化包含Ch2/Ch3区的多肽的方法，其包括以下步骤 (a)使所述多肽与A蛋白结合；和 (b)用洗脱缓冲液以起始于5.O或5. O以下的pH梯度洗脱所述多肽，其中所述洗脱缓冲液包含高PH缓冲液和低pH缓冲液，且其中通过调节各pH缓冲液在所述洗脱缓冲液中的百分比来形成所述pH梯度。33.权利要求32的方法，其中所述高pH缓冲液为约pH5. O，且其中所述低pH缓冲液为约pH 2.7。34.权利要求32的方法，其中低pH缓冲液的百...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·布朗，C·J·多德，A·N·拉达莫汉，
申请(专利权)人：弗·哈夫曼拉罗切有限公司，
类型：发明
国别省市：