本发明专利技术涉及在修饰的酵母宿主细胞，例如巴斯德毕赤氏酵母中生产高滴度重组蛋白质的方法，其中相对于相同物种的未修饰的酵母宿主细胞，所述修饰的酵母细胞缺乏液泡分选活性或具有降低的液泡分选活性。在特定的实施方式中，通过删除或破坏编码Vps10或Vps10同源物的基因来降低或消除液泡分选活性。本发明专利技术还涉及根据在此公开的方法被修饰的修饰的酵母细胞。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在包括酵母细胞的真菌细胞中以提高的分泌效率生产重组蛋白质的方法和组合物。对电子提交的序列表的引用 本申请的序列表是通过EFS-Web电子提交的，是ASCII格式的序列表，文件名为“GF頂IS00004_SEQTXT_180CT2010. TXT”、创建日期 2010 年 10 月 18 日、大小 861kB。通过EFS-Web提交的该序列表是说明书的一部分，通过完全引用合并在此。
技术介绍
由于当前对生物治疗剂的关注，在真核细胞中表达重组蛋白质变得越来越重要，生物治疗剂是FDA管理的药物中增长最大的部分。无论生产细胞是基于CHO的哺乳动物细胞系还是糖工程化的(glycoengineered)巴斯德毕赤氏酵母(Sethuraman and Stadheim,Curr. Opin. Biotechnol. 17 :341-346 (2006))，最大的分泌滴度都是关键的。提高蛋白质生产的许多努力集中于启动子和重组基因的拷贝数(Daly and Hearn, J. Mol. Recognit. 18 1999-38(2005))，只有重组蛋白质沿着从内质网(ER)到高尔基体、随后反式高尔基网络、最后到细胞外囊泡以递送通过质膜的特定路径转运，才能实现分泌。如果重组蛋白质偏离了这个期望的途径，产量将下降。与哺乳动物细胞相比，糖工程化的酵母提供了用于治疗剂开发的独特的优势。例如，基于哺乳动物细胞的系统的糖基化分布是异源的(Li et al. , Nat. Biotechnol. 24 210-15(2006))，而糖工程化的巴斯德毕赤氏酵母被证明提供了均匀的糖基化(Hamiltonet al. , Science 313:1441-43(2006))。虽然哺乳动物糖基化的遗传学修饰是可能的，例如，消除海藻糖(Shinkawa et al. , J. Biol. Chem 278 :3466-73 (2003)),大多数糖形式选择必需在发酵和/或纯化步骤时发生，常常限制产量。酵母菌中遗传操作的容易性提供了与哺乳动物宿主细胞相比、独立于发酵和纯化来改善蛋白质产量的机会。在酵母中，被递送到液泡的内源蛋白质被蛋白酶类降解。酵母液泡是一种细胞器，类似于哺乳动物溶酶体，对于内吞作用、蛋白质周转和营养物获取以维持细胞自我稳定是非常重要的。液泡蛋白质运输的一种机制是羧肽酶Y途径，其从反式Golgi网络(TGN)递送蛋白质。在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，对TGN中羧肽酶Y的起始相互作用负责的蛋白质受体被称为VpslO (也称为P印I或Vptl)、Vthl和Vth2。在酿酒酵母中，VpslO起作用来将居于液泡中的蛋白酶递送到前液泡区室，弓I起液泡中最终的蛋白水解作用(综述参见，Bowers and Stevens, Biochim. Biophys. Acta 1744:438-54(2005) ；Li andKane,Biochim.Biophys. Acta. 1983 :650-663(2009)，epub Aug. 2008)。Marcusson 等人(Cell 77 :579-586 (1994))显示了在酿酒酵母中，VpslO 是 Cpy 向酵母液泡的分选所需的。Marcusson等人进一步显示了 VPSlO基因的突变引起内源Cpy的缺陷性液泡蛋白质分选，引起它的分泌。然而，还显示的是，VPSlO的破坏和VpslO活性的丧失对液泡酶PrA和PrB的分选没有任何影响，在VPSlO基因被敲除的酿酒酵母菌株中它们适当地通过通往液泡的途径。Iwaki等人(Microbiology 152 :1523-32(2006))也显示了在粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)中VPSlO的删除引起了 Cpy的错误分选和分泌,表明VpslO是将Cpy分选到液泡所需的。VpslO分选受体也显示了在Cpy分选中以类似于粟酒酵母(Saccharomyces pombe)的方式起作用(Takegawa et al. , Curr Genet. 42 (5)252-9(2003) ；Iwaki et al. , Microbiology 152(5) : 1523-32(2006))。J. Denecke (美国专利申请No. 2005/0019855)公开了通过防止蛋白质输出到ER之外和/或将蛋白质从液泡分选途径重定向回到ER或细胞表面来限制蛋白水解作用的方法。、它进一步提出了，液泡分选受体VpslO可以被这样修饰，从而将蛋白质重定向回到ER，从而提闻异源蛋白质表达。Idiris 等人(Appl Microbiol. Biotechnol. 85 (3) :667-77 (2010), Epub 2009 Aug11)描述了在菌株A8-vpslOA中2倍提高的人生长激素(hGH)分泌，与仅有八个蛋白酶删除的AS菌株相比，这是一种包含VPS10删除以及八个蛋白酶基因删除的粟酒裂殖酵母菌株。然而，细胞内地保持了低水平的r-hGH分泌，这表明与细胞内蛋白质滞留相关的几种VPS基因必需被删除以完全地阻断液泡积累途径。Takegawa等人(上文)还描述了粟酒裂殖酵母的vpslO缺陷菌株,显示了 Cpy在这种突变株中不被加工成其成熟形式。然而，这项研究没有描述在vpslOA菌株中异源治疗蛋白质的表达。Agaphonov 等人(FEMS Yeast Research 5:1029-1035(2005))灭活了多形汉逊酵母(Hansenula poIymorpha)中的VPS10基因，没有观察到人类尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)的分泌提高。在这项研究中，在VPS10缺陷菌株中观察到了 uPA的蛋白水解加工的提高。高度希望的是通过消除或降低液泡分选活性来开发提高真菌或酵母细胞中产生的异源蛋白质产量的方法。专利技术概述本专利技术特别地涉及在酵母或真菌宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，包括(a)用编码蛋白质的表达载体转化遗传修饰的酵母或真菌宿主细胞来产生宿主细胞，其中相对于相同物种的未修饰的酵母或真菌宿主细胞，所述遗传修饰的酵母或真菌细胞缺乏液泡分选活性，或具有降低的液泡分选活性；(b)在诱导发酵条件中蛋白质表达的条件下在培养基中培养所述转化的酵母或真菌宿主细胞；以及(C)从所述转化的酵母或真菌宿主细胞或培养基分离所述蛋白质。在本专利技术的这个方面的某些实施方式中，所述酵母或真菌宿主细胞选自以下构成的组巴斯德毕赤氏酵母、酿酒酵母、黑曲霉(Aspergillusniger)、粟酒酵母(Saccharomyces pombe)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、树干毕赤酵母(Pichia stipitis)、汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)和多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)(也称为安格斯毕赤酵母,Pichia angusta)。在一个优选的实施方式中，宿主细胞是毕赤氏酵母细胞，在特定的实施方式中，宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母。在本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.10.30 US 61/256379;2010.06.02 US 61/3506681.ー种相对于野生型巴斯德毕赤氏酵母细胞缺乏液泡分选活性或具有降低的液泡分选活性的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述宿主细胞包含液泡蛋白质分选受体10-KVPS10-1)的功能性删除。2.权利要求I的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述细胞包含表达载体，所述表达载体包含编码异源蛋白质的核苷酸的序列。3.权利要求2的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述异源蛋白质是糖蛋白。4.权利要求3的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述细胞被修饰以表达糖蛋白，在所述糖蛋白中糖基化模式是人类样的。5.权利要求1-4的任一项的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中编码VPS10-1的基因被删除，以及编码VPS10-2的基因不被删除。6.权利要求1-4的任一项的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中编码VPS10-1的基因包含使得编码的VpslO-I蛋白质无功能或没有液泡分选活性的突变。7.权利要求1-4的任一项的巴斯德毕赤氏酵母细胞，其中所述VpslO-I活性的功能性删除包括选自以下构成的组的改变=VPSlO-I基因的上游或下游调节序列的删除或破坏，通过VpslO-I蛋白质的化学、肽或蛋白质抑制物的液泡分选活性的取消，通过基于核酸的表达抑制物的液泡分选活性的取消，以及通过转录抑制物的液泡分选活性的取消。8.ー种在酵母或真菌宿主细胞中生产重组蛋白质的方法，包括 a.用编码蛋白质的表达载体转化遗传修饰的酵母或真菌细胞来产生宿主细胞，其中相对于相同物种的未修饰的酵母或真菌细胞，所述遗传修饰的酵母或真菌细胞缺乏液泡分选活性，或具有降低的液泡分选活性； b.在诱导发酵条件中蛋白质表达的条件下在培养基中培养所述转化的酵母或真菌宿主细胞；以及 c.从所述转化的宿主细胞或培养基分离所述蛋白质。9.权利要求8的方法，其中所述酵母或真菌宿主细胞选自以下构成的组巴斯德毕赤氏酵母、酿酒酵母、黑曲霉、粟酒裂殖酵母、白色念珠菌、光滑念珠菌、树干毕赤酵母、汉逊德巴利酵母、乳酸克鲁维酵母和多形汉逊酵母。10.权利要求8或9的方法，其中通过从酵母或真菌细胞基因组中删除或破坏编码VPSlO或VPSlO同源物的基因，来消除或降低液泡分选活性。11.权利要求10的方法，其中所述酵母或真菌宿主细胞是巴斯德毕赤氏酵母。12.权利要求11的方法，其中VP...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·米尔，H·林，BK·蔡，
申请(专利权)人：默沙东公司，
类型：发明
国别省市：
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