本发明专利技术提供一种蛋白质COPS2在制备诊断胃癌的试剂中的应用及诊断试剂盒，采用现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质COPS2的IgG抗体；用纯化的人蛋白质COPS2抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入待测血清，再加入含有辣根过氧化物酶（HRP）标记的anti-HumanIgG抗体的酶标试剂，形成COPS2-抗体-酶标二抗复合物，经过彻底洗涤后加酶底物溶液TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，用颜色的深浅检测样品中COPS2的IgG抗体的水平。本发明专利技术所提供的试剂盒，作为辅助胃癌早期诊断的一种手段，大大提高胃癌早期诊断的敏感性和特异性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物科学领域，更具体地说，涉及ー种蛋白质C0PS2在制备诊断胃癌的试剂中的应用及诊断试剂盒。
技术介绍
胃癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤，根据世界卫生组织(WHO) 2008年的统计(世界卫生组织年度统计，2008)，在全世界范围，胃癌病人的死亡率高居第二。在2006年WHO的统计中显示有接近950，000个新发病例，同时有约700，000人死于这ー种疾病。在我国，毎年胃癌新发患者数超过30万，死于胃癌的人数约16万，病死率居恶性肿瘤之首，严重 威胁人民生命健康(陈竺，全国第三次死因回顾抽样调查报告，2008)。为降低死亡率，提高胃癌的疗效，关键是胃癌的“三早”工作，即早期发现、早期诊断及早期治疗。然而，由于绝大多数胃癌患者缺乏特异性的临床症状，故早期胃癌诊断率很低，手术率不足10% (吴云林外科理论与实践，2005，10 :401);术后病人的生存期也较短。目前，我国胃癌总体5年生存率为43. 4%，术后病理分期(pathological TNM，pTNM) I、II、III、IV期患者的术后5年生存率分别为75. 65%,58. 73%,28. 01%和8. 42% (刘炳亚中华胃肠外科杂志，2010，13:163)。因此，提高胃癌的早期诊断率非常重要。而一般体检和影像学检查作用有限，待能够发现和明确诊断时，往往已到了中、晩期，缺少预警价值。因此，从长远角度看，应致カ于发现敏感性和特异性均较好的肿瘤标志物。此外，胃癌异质性大，预后及对治疗的反应性差别较大，对于临床评估预后以及对治疗反应性的预测与评价，均需良好的肿瘤标志物。理想的肿瘤标志物应符合以下条件(I)敏感性高；(2)特异性高；(3)肿瘤标志物浓度和肿瘤大小、转移、恶性程度有关，能协助肿瘤分期和判断预后；(4)半衰期短，有效治疗后浓度很快下降，能较快反映体内肿瘤的实际情况；(5)存在于体液，特别是血液中，易于检测(刘炳亚中华胃肠外科杂志，2010，13 :163)。肿瘤血清标志物的研究一直是本领域的研究重点。现已有多种胃癌肿瘤标识物如癌胚抗原(CEA)，存在于胃癌及其它腺癌患者的血清中，但对早期胃癌的诊断意义较小，主要用于胃癌治疗前后的动态观察(Lipkin M Cancer Research, 1988,48 235 ；Lipkin JBC Supplymental, 1992，16 :1) ;CA125、CA 19-9, CA50、CA724 以及 CA242 等部分糖抗原在部分胃癌患者中可升高，但其敏感性仅20 40% (Kodera Y The American journal ofgastroenterology,1996,91 :49 ；Chou M !Disease Markers,2000,16 :105 Lai IR etal Hepato—gastroenterology，2002，49 :115 Edip U et al !Advances in Theray，2008，25 :1075);还有研究发现肿瘤相关糖蛋白抗原-72 (TAG-72)对胃癌的敏感性为69 %，特异性为84% (刘军等实用医学杂志，1999，15 :4);糖蛋白抗原MG7_Ag在血清中有40%-60%的阳性检出率，在胃癌组织中有80%-94%的阳性检出率(Ren J =Cancer, 2000,88 280)；核小体组蛋白类抗原(IP0-38)作为胃癌诊断的敏感性为57.4%，特异性超过90% (Hao Yetal J Proteome Res，2008，7 :3668)以上这些指标均有利于早期胃癌的诊断。某些肿瘤基因，如DDC、c-myc、c_erb_2、p53以及nm23等对胃癌的发生、转移也有一定意义,但广泛应用于临床仍受限制(刘倩等，人民卫生出版社，2004)。由于现有的胃癌生物标识物在灵敏度和特异性上的缺陷，虽然在疗效监测、提示复发、判断预后和高危人群的普查中具有一定的价值，但目前仍不能用于胃癌的确诊。为了实现对胃癌的早期高灵敏性，高特异性的诊断，急需在分子水平上寻找到更敏感、更特异的胃癌生物标志物。我们在前期研究中利用人蛋白质组芯片高通量、快速分析的优势，分析了胃癌病人相关血清101份(胃癌病人37份、高危病人14份、健康人血清50份)，在较短时间内比较了患者和健康人样品中的不同，给出了候选血清生物标志物，以期早期诊断和有效治疗胃癌。蛋白C0PS2(C0P9 constitutive photomorphogenic homo log subunit 2)是 C0P9构成性光敏形态发生同源物亚基2，是C0P9信号复合体(C0P9 sinalosome, CSN)的ー种亚型。CSN最初是在对拟南芥种子植入发育的光形态发生的遗传学分析中被发现，是植物 光形态发生的ー个负调节子，是ー个E3连接酶的调节因子，可以促进NEDD8/RUBI从特定的E3连接酶上解离下来。真核生物的C0P9信号复合体是细胞内高度保守的多亚基蛋白质复合物，主要定位于细胞核，在结构上与26S蛋白酶体亚复合物高度相关。CSN的具体功能目前尚未明确，主要体现为两方面的活性脱Nedd化作用和磷酸化作用；在细胞内同SCF遍在蛋白连接酶复合体等许多蛋白质复合物发生相互作用；调节多种信号分子靶向遍在蛋白-26S蛋白酶体的稳定性。因此，CSN是连接信号转导与蛋白质降解的分子平台(王妍生命的化学，2004，5 :4)。目前，尚未见有将C0PS2蛋白质作为胃癌生物标志物的报导。
技术实现思路
针对上述现有技术中存在的技术问题，本专利技术提供ー种蛋白质C0PS2在制备诊断胃癌的试剂中的应用及诊断试剂盒，来定性检测人血清中的抗蛋白质C0PS2的IgG抗体的水平，作为辅助胃癌早期诊断的ー种手段，大大提高胃癌早期诊断的敏感性和特异性。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案如下蛋白质C0PS2在制备诊断胃癌的试剂中的应用。—种制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒,该试剂盒采用现在临床广泛使用的ELISA技木，应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质C0PS2的IgG抗体；具体是用纯化的人蛋白质C0PS2抗原通过包被缓冲液稀释后包被在酶标板上的微孔内制成固相抗原，加入封闭液；将标准品与待测血清样品用样品稀释液稀释后加入各自的抗原测定孔中，每孔加入含有辣根过氧化物酶(HRP)标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂，形成C0PS2-抗体-酶标ニ抗复合物，经洗涤液彻底洗涤后加酶底物溶液显色，酶底物溶液反应时间到后加入酸性終止液；所述酶底物溶液在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最終的黄色，利用顔色的深浅来检测样品中抗蛋白质C0PS2的IgG抗体的水平。所述纯化的人蛋白质C0PS2 (带GST标签)是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到，浓度为251^/111し所述标准品包括0U/mL标准血清I和100U/mL标准血清2,分别为正常人血清以及C0PS2抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中。所述酶标试剂含HRP- ニ抗O. 1-1 μ g/mL。所述酶底物溶液包括显色剂A :500mL溶液中含醋酸钠13. 6g，柠檬酸I. 6g,30%双氧水 O. 3mL、显色剂 B 500mL本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.蛋白质C0PS2在制备诊断胃癌的试剂中的应用。2.ー种制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，该试剂盒采用现在临床广泛使用的ELISA技术，应用间接法定性检测人血清中抗蛋白质C0PS2的IgG抗体；具体是用纯化的人蛋白质C0PS2抗原通过包被缓冲液稀释后包被在酶标板上的微孔内制成固相抗原，加入封闭液；将标准品与待测血清样品用样品稀释液稀释后加入各自的抗原测定孔中，每孔加入含有辣根过氧化物酶(HRP)标记的anti-Human IgG抗体的酶标试剂,形成C0PS2-抗体-酶标ニ抗复合物，经洗涤液彻底洗涤后加酶底物溶液显色，酶底物溶液反应时间到后加入酸性終止液；所述酶底物溶液在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最終的黄色，利用顔色的深浅来检测样品中抗蛋白质C0PS2的IgG抗体的水平。3.根据权利要求I所述的制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述纯化的人蛋白质C0PS2是从酿酒酵母中过量表达，亲和纯化而得到，浓度为25μ g/mL。4.根据权利要求I所述的制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述标准品包括OU/mL标准血清I和100U/mL标准血清2，分别为正常人血清以及C0PS2抗体为阳性的血清稀释于样品稀释液中。5.根据权利要求I所述的制备诊断胃癌疾病的诊断试剂盒，其特征在于，所述酶底物溶液包括显色剂A :500mL溶液中含醋酸钠13. 6g，柠檬酸I. 6g，30%双氧水O. 3mL、显色剂B 500mL 溶液中含 TMB 350mg, DMSO 20m...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨丽娜，陶生策，刘炳亚，王靖方，郭书娟，朱正纲，李建芳，燕敏，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。