本发明专利技术公开了一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的荧光定量PCR试剂盒及其应用，该试剂盒包括：TaqDNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的引物和一条TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的引物和一条TaqMan探针。本发明专利技术利用多重荧光实时定量PCR的原理兼顾PCR技术的高效性、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确性等优点，达到了同步且定量检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的目的，为提高食品监管效率和水平、预防食物中毒和食源性疾病的发生提供保障。同时，本发明专利技术也为提高生产加工环节食品安全风险监测、分析与风险预警能力和水平等奠定了基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测试剂盒，尤其涉及一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒，属于单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的检验检疫领域。
技术介绍
随着世界经济全球化、贸易自由化和食品国际贸易的迅速发展，食品安全已成为事关人民健康和构建和谐社会的重大战略问题。而食源性疾病在食品安全问题中又占据非常重要的地位。WHO将食源性疾病定义为存在于自然界中的有污染性或毒性的因子(包括病毒、寄生虫、细菌和农业、环境、危险化学品以及生物毒素)通过进食而进入身体引起的疾病(任玉华，田海霞.食品安全与食源性疾病[J].职业与健康，2005，21 (12)1977-1978.)。爆发的食源性疾病中多数是由致病性细菌引起(张敏，童华荣，张丽平.动 物性食品安全现状及其对策[J].食品工业科技，2005 (5) :182-186)。其中，单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌是比较重要的两种食源性致病菌(刘圆圆.沙门氏菌、金黄色葡萄球菌及单增李斯特菌的同步快速检测方法的研究[D].华南理工大学，2010，1-86)。单增李斯特菌是一种能引起人畜共患的致病菌，致死率高达30%，对于免疫缺陷病人致死率甚至高达70%。该菌在欧美日等发达国家的危害程度甚至超过沙门氏菌食物中毒。根据美国疾病控制中心的研究报告估计，美国每年有7600万人食物中毒，约有5000人死于食物中毒，其中单增李斯特菌、出血性大肠杆菌0157:H7和多种抗生素耐药性鼠伤寒沙门氏菌引起的食源性疾病最为突出(张兰荣，唐一清，甄博捃，等.通州区6类食品单增李斯特菌污染状况及分子流行病学特征调查研究[J].中国卫生检验杂志，2007，17 (12)2306-2308)。WHO关于单增李斯特菌食品中毒报告中指出，各类产品中，新鲜肉类及肉类制品中含有单增李斯特菌的比例最高(何欣荣等，2002)。金黄色葡萄球菌是人和动物的常见病原菌，在自然界中无处不在。在美国，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒33%，加拿大则更多，占45%。中国每年发生的此类中毒事件也非常多。2003年中国食源性疾病暴发的监测资料分析显示，在微生物食源性疾病爆发中，金黄色葡萄球菌占9. 4%，仅次于副溶血弧菌和变形杆菌。且报道显示，引起食源性疾病的动物类食品中以肉及肉制品最多，高达68% (刘秀梅，陈艳，樊永祥，等.2003年中国食源性疾病暴发的监测资料分析[J].卫生研究，2006，35 (2)201-204)。有鉴于此，开展食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌同步、快速检测方法的研究具有重要意义。目前较为常用的检测方法是传统分离鉴定方法和普通PCR方法。但传统的分离鉴定方法，操作繁琐，耗时耗力，不能满足快速检测的需求(Churchill R L T,LeeHiHall J C. Detection of Listeriamonocytogenes and the toxin listeriolysin 0 infood. Journal of M icrobiological Methods，2006，64 (2) :141 170)。常规 PCR 法需要琼脂糖凝胶电泳后续处理，费时费力，还增加了对环境造成污染的可能性。迄今为止，尚缺乏一种灵敏性高、稳定性好的能够同时检测食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒及检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒；本专利技术的目的之二是提供一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法；本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒，包括Taq DNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物和一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物和一条检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针。 其中，所述的一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNo. I和SEQ ID No. 2所示，所述的一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示，在SEQ ID No. 3所示探针的5'端连接有荧光报告基团，3'端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是FAM，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse。所述的一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ IDNo. 4和SEQ ID No. 5所示，所述的一条检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 6所示，在SEQ ID No. 6所示探针的5'端连接有荧光报告基团，3^端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是J0E，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse。JOE的吸收发射波长与FAM的吸收发射波长不交叉，两条探针可用Mx3005P荧光定量PCR仪同时检测，且荧光信号互不影响。此外，两条探针3'端选用Eclipse非荧光淬灭基团，本身不产生荧光且淬灭效率更高，大大降低了本底信号的强度。所述的荧光定量PCR扩增缓冲液中含有25mM的dNTPs和25mM的Mg2+ ；为了达到更好的检测效果，上述试剂盒中还可含有单增李斯特菌标准质粒和金黄色葡萄球菌标准质粒作为阳性标准模板，所述的单增李斯特菌标准质粒和金黄色葡萄球菌标准质粒可以通过各种商业途径购买得到，本领域技术人员也可按照本领域的常规技术手段制备得到单增李斯特菌标准质粒和金黄色葡萄球菌标准质粒；此外，本专利技术试剂盒中还可含有阴性质控标准品。基于目前尚缺乏用于食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌同步且定量的检测方法，本专利技术的另一目的是提供一种同时检测食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法，实现对单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的同步、快速、特异、定量的检测，为食品中食源性致病菌的高通量检测奠定基础。本专利技术的另一目的是通过以下技术方案来实现的一种同时检测食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法，包括以下步骤(I)提取待检测食品的DNA; (2)在PCR扩增管中加入以下试剂建立PCR扩增体系所提取的待检测食品的DNA，Taq DNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物和一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物引物和一条检测金黄色葡萄球菌的探针；(3)将所建立的PCR扩增体系在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，根据扩增曲线、标准曲线或/和Ct值对样品中的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌进行定性分析和定量分析。至于如何对单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌进行定性和定量分析，这些分析方法或手段属于本领域的常规技术手段，为本领域技术人员所公知道。作为参考，本领域技术人员可采用以下方式进行定性分析和定量分析定性分析首先设定阈值；阈值样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动设置的原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且尽量使回归系数最大；也就是在扩增曲线的指数期划一条直线，这本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种同时检测单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR试剂盒，包括Taq DNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物和一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物和一条检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针；其特征在于所述的一对扩增单增李斯特菌引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示，所述的检测单增李斯特菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示；所述的一对扩增金黄色葡萄球菌引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示，所述的检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 6所示。2.按照权利要求I所述的的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于所述的荧光定量PCR扩增缓冲液中含有dNTPs和Mg2+。3.按照权利要求I所述的的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于 在SEQ ID No. 3所示探针的5'端连接有荧光报告基团，3'端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是FAM，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse ； 在SEQ ID No. 6所示探针的5'端连接有荧光报告基团，3'端连有非荧光淬灭基团；优选的，所述的荧光报告基团是JOE，所述的非荧光淬灭基团是Eclipse。4.按照权利要求1-3任何一项所述的的双重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于含有单增李斯特菌标准质粒和金黄色葡萄球菌标准质粒；此外，该试剂盒还含有阴性质控标准品。5.一种同时检测食品中单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌的双重荧光定量PCR方法，包括以下步骤(I)提取待检测食品的DNA ；(2)建立PCR扩增体系所提取的待检测食品的DNA, Taq DNA聚合酶，荧光定量PCR扩增缓冲液，灭菌去离子水，一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物和一条检测单增李斯特菌的TaqMan探针，一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物和一条检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针；(3)将所建立的PCR扩增体系在荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，根据扩增曲线、标准曲线或/和Ct值对样品中的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌进行定性或定量分析；其中，所述的一对扩增单增李斯特菌的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No. I和SEQ ID No. 2所示，所述的检测单增李斯特菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 3所示；所述的一对扩增金黄色葡萄球菌的上、下游引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示，所述的检测金黄色葡萄球菌的TaqMan探针的核苷酸序列为SEQ ID No. 6所示。6.按照权利要求5所述的双重荧光定量PCR方法，其特征在于所述的荧光定量PCR扩增缓冲液中含有dNTPs和Mg2+ ; 在SEQ ID No. 3所示探针...
【专利技术属性】
技术研发人员：邵美丽，于国萍，许岩，张秀玲，边亚娟，赵艳丽，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
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