本发明专利技术公开了一种低聚半乳糖的制备方法，包括：（1）使用戊二醛在15-35℃下与大孔弱碱苯乙烯树脂在搅拌下反应16-24h，使树脂活化；（2）取液体β-半乳糖苷酶与步骤（1）所得的活化的大孔弱碱苯乙烯树脂在15-35℃下搅拌反应16-24h，得到固定化的β-半乳糖苷酶；（3）将固定化的β-半乳糖苷酶加入乳糖溶液中，于48-52℃搅拌反应24-36h。采用本发明专利技术的方法生产低聚半乳糖能使糖浆过滤工艺中过滤压力保持稳定，提高低聚半乳糖的得率，既降低了能耗，又能满足工业化生产的要求。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，特别是ー种利用固定化酶生产低聚半乳糖的方法。
技术介绍
低聚半乳糖(galacto-oligosaccharide, G0S)是ー类天然存在于动物母乳中的功能性低聚糖，具有出色的保水力和极强的酸热稳定性，不能被人小肠消化吸收，但可被结肠菌群发酵，能促进双歧杆菌増殖，抑制有害病原菌和腐败菌生长，促进钙、镁、钾的吸收，有利于B族维生素、烟酸和叶酸的生成，能有效刺激肠道蠕动，減少和防止便秘的发生，降低结肠中有毒物质的含量等调节肠道微生态、促进肠道健康的作用。低聚半乳糖是以乳糖为原料经β -半乳糖苷酶(EC3. 2. I. 23)催化制得，是在乳糖 分子中的低聚半乳糖基上以β (I —2)键或β (I —3)、β (I —4)键、β (I —6)键连接I 4个半乳糖分子的寡糖类混合物。目前通常使用游离细胞或游离β-半乳糖苷酶酶来生产低聚半乳糖。在生产过程中，产品会引入游离细胞或蛋白质等杂质，需要增加复杂的提纯エ艺，不利于清洁生产。为了解决此问题，已研究出将细胞进行固定化，并利用固定化的细胞生产低聚半乳糖的方法。该方法能简化生产エ艺，含β_半乳糖苷酶的固定化细胞可以重复利用，节省了生产成本。固定化细胞常采用海藻酸钙包埋法，在利用固定化细胞转化乳糖的过程中，由于温度较高且海藻酸钙机械強度差，导致固定化细胞容易破碎，从而引入糖浆中，造成糖浆在后续过滤エ序中容易堵塞过滤装置，使过滤压力升高较快。另外，目前用于生产β -半乳糖苷酶的菌种有脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces Iactis)等微生物。其中，脆壁克鲁维酵母所产的β_半乳糖苷酶为胞内酶，乳酸酵母、黑曲霉、米曲霉、米根霉等所产的β_半乳糖苷酶为胞外酶。胞内β_半乳糖苷酶的获取需要进行破碎菌体、分离提纯等步骤，这增加了生产环节和生产设备，同时耗能也増加。若菌株直接将半乳糖苷酶分泌到胞外，则大大方便了酶的分离和利用，并且节省生产成本。已知环状芽孢杆菌所产的半乳糖苷酶为胞外酶，并具有耐高温的性质，但是利用环状芽孢杆菌生产β_半乳糖苷酶的报道很少。
技术实现思路
本专利技术的ー个目的在于提供，利用该方法能够获得较高的低聚半乳糖得率。本专利技术的另ー个目的在于提供ー种固定化β -半乳糖苷酶的制备方法，利用该方法制备的固定化酶具有机械强度高、物化性能稳定等优点，能够有效解决采用海藻酸钙包埋法制备的固定化细胞或固定化酶生产低聚半乳糖的过滤エ序中过滤压力上升较快的问题。本专利技术的又ー个目的在于提供ー种利用环状芽孢杆菌(Bacillus circulars)生产β_半乳糖苷酶的方法，该方法能够显著提高β_半乳糖苷酶的产量。本专利技术所采用的技术方案是，包括以下步骤(I)使用戊ニ醛在15-35°C下与大孔弱碱苯こ烯树脂在搅拌下反应16_24h，使树脂活化；(2)取液体半乳糖苷酶与步骤(I)所得的活化的大孔弱碱苯こ烯树脂在15-35°C下搅拌反应16-24h，得到固定化的β -半乳糖苷酶；(3)将固定化的半乳糖苷酶加入乳糖溶液中，于48_52°C搅拌反应24_36h。优选地，步骤(2)所述的β -半乳糖苷酶在使用前经盐析进行提纯。优选地，步骤(2)中β -半乳糖苷酶与大孔弱碱苯こ烯树脂的配比为100_200U/g树脂；步骤(3)中所加入的乳糖浓度为45%-52% (w/w)，并按照每千克乳糖(按干基计)加入6000-10000U的固定化β -半乳糖苷酶。优选地，步骤(2)中所述β -半乳糖苷酶由环状芽孢杆菌产生。优选地，步骤(2)中所述半乳糖苷酶经以下步骤制备Α.将保存的环状芽孢杆菌接种至LB固体培养基，于36_38°C下培养16_24h，使菌种活化；B.取活化的菌种接种至20_50ml的LB液体培养基中，振荡培养46h后接种至装有LB培养基的种子罐中，于36-38°C下培养4-6h，得到种子培养液； C.将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中培养36_48h，得到环状芽孢杆菌发酵液；D.将发酵液经微滤或离心除去菌体，再将所得酶液浓缩，得到液体半乳糖苷酶。优选地，上述环状芽孢杆菌为环状芽孢杆菌ATCC No. 31382。优选地，步骤C所述培养的方式为将种子培养液接入发酵罐中培养16_24h后，以补料量4-6g ·じ1以及补料速度为O. 4-0. 6g ·じ1 · h-1的方式补加乳糖，继续发酵20-28h。优选地,步骤C所述发酵培养基为乳糖5_15g/L、半乳糖5-10g/L、大豆蛋白胨10-30g/L、玉米浸提液4-6g/L、酵母提取物2-4g/L、磷酸氢ニ铵2_4g/L、碳酸钠l_2g/L、大豆油 8-15g/L、消泡剂 O. 5-2g/L。优选地，步骤C中所述培养的条件为温度36_38°C、pH6. 8-7. 5、溶氧彡30%、通气量 O. 5-2V · Ti · mirT1、搅拌速度 120_220rpm。ー种由上述方法制备得到的低聚半乳糖，包括浆状产品和粉状产品。本专利技术的有益效果是本专利技术采用固定化β_半乳糖苷酶生产低聚半乳糖，固定化所采用的树脂机械强度高、物化性能稳定，在乳糖的转化过程中不会发生变化，也不容易破碎，因而不会堵塞过滤装置，能够使压力保持稳定，克服固定化细胞所带来压力上升较快的问题。生产过程中所用的固定化酶可以回收重复使用，其使用效率比游离的β_半乳糖苷酶要高得多，具有适合エ业化规模生产的特点。本专利技术制备低聚半乳糖的生产エ艺简单易行，操作便利，可满足エ业化大生产的要求，低聚半乳糖的得率> 57%。本专利技术采用环状芽孢杆菌生产半乳糖苷酶，由于环状芽孢杆菌所产的半乳糖苷酶为胞外酶，因此后续的酶的分离纯化过程大为简化，从而节省了分离纯化的设备和成本。同时，该菌种所产的β -半乳糖苷酶具有耐高温的性质，因此，生产低聚半乳糖的过程可以在较高温度下进行，由此带来至少以下好处第一，在高温下反应可減少微生物的污染；第二，高温下乳糖的溶解度更高，越高的乳糖初始浓度低聚半乳糖的得率就越高；第三，β -半乳糖苷酶在低温、低乳糖浓度下一般表现为水解乳糖的活性，合成的低聚半乳糖较少。另外，本专利技术对环状芽孢杆菌产β-半乳糖苷酶的发酵方式、培养基及发酵条件进行了改进，使β-半乳糖苷酶的产酶能力得到了一定的提高。具体实施例方式以下实施方式中使用的产半乳糖苷酶的菌株环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)购自美国菌种保藏中心(ATCC)，编号为31382。但本专利技术所用的菌株不限于环状芽孢杆菌ATCC No. 31382，其它环状芽孢杆菌也适用于本专利技术。以下对描述本专利技术的几个概念进行说明。 游离β -半乳糖苷酶酶活测定在ImL含有浓度为4mg/mL的ONPG O. IM磷酸缓冲液中(pH 6. O)加入ImL β -半乳糖苷酶酶液，在50°C反应lOmin，加入2mL10%碳酸钠溶液終止反应，通过测定产物中邻硝基酚含量计算邻硝基酚半乳糖苷(ONPG)的水解量。在该条件下每分钟水解I μ M ONPG所需的酶量定义为ー个酶活单位(U)。低聚半乳糖的含量測定參照AOAC Official Method 2001.本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种低聚半乳糖的制备方法，包括以下步骤 (1)使用戊二醛在15-35°C下与大孔弱碱苯乙烯树脂在搅拌下反应16-24h，使树脂活化； (2)取液体￠-半乳糖苷酶与步骤(I)所得的活化的大孔弱碱苯乙烯树脂在15-35°C下搅拌反应16-24h，得到固定化的P -半乳糖苷酶； (3)将固定化的P-半乳糖苷酶加入乳糖溶液中，于48-52°C搅拌反应24-36h。2.根据权利要求I所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中步骤(2)所述的￠-半乳糖苷酶在使用前经盐析进行提纯。3.根据权利要求I所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中步骤(2)中￠-半乳糖苷酶与大孔弱碱苯乙烯树脂的配比为100-200U/g树脂；步骤(3)中所加入的乳糖浓度为45%-52% (w/w),并按照每千克乳糖(按干基计)加入6000-10000U固定化P -半乳糖苷酶。4.根据权利要求I所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中步骤(2)中所述￠-半乳糖苷酶由环状芽孢杆菌产生。5.根据权利要求I所述的一种低聚半乳糖的制备方法，其中步骤(2)中所述￠-半乳糖苷酶经以下步骤制备 A.将保存的环状芽孢杆菌接种至LB固体培养基，于36-38°C下培养16_24h，使菌种活化； B.取活化的菌种接种至20-50ml的LB液体培养基中，振荡培养4_6h后接种至装有LB培养基的...
【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪经，曾宪纲，陈子健，陈振鹏，肖桂秋，
申请(专利权)人：江门量子高科生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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