本发明专利技术公开了一种重组人Ⅱ型肿瘤坏死因子受体抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)的纯化方法，所述的方法包括步骤：(1)将含有rhTNFR-Fc粗品的溶液和疏水层析介质接触，使rhTNFR-Fc上样到疏水层析介质上；和(2)用洗脱缓冲液将rhTNFR-Fc从疏水层析介质上洗脱下来，得到纯化的rhTNFR-Fc。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及蛋白质纯化，尤其涉及一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白的纯化方法。
技术介绍
类风湿性关节炎的诱因尚在研究之中，可能包括感染、自身免疫及遗传等因素。这种对人体不利的非正常发炎反应与免疫系统中某些细胞生长因子的失衡有密切的关系。TNF (肿瘤坏死因子)是这类细胞生长因子中的重要一员。抑制TNF的活性成为治疗类风湿性关节炎最关键的环节之一。TNFR-Fc是TNFR (肿瘤坏死因子受体)与人免疫球蛋白IgG的Fe片段组成的融合蛋白。TNFR可以分为两型1型TNFR和II型TNFR，它们都可以从细胞表面脱落形成可溶性 TNF受体，即sTNFRI与sTNFRII。由于这些可溶性的TNFR可与TNF结合，所以又被称为TNF结合蛋白，两种受体中以II型分布更为广泛，与肿瘤坏死因子的结合力更强。一般认为，可溶性TNFR可以结合TNF，从而抑制TNF的活性，可以作为TNF的拮抗剂。由于TNFR-Fc可以通过Fe形成二聚体结构，比非聚体的sTNFR更加稳定。TNFR-Fc通过竞争性地与血中TNF结合，阻断它和细胞表面TNFR的结合，从而减少滑膜细胞的增生，抑制软骨细胞、纤维母细胞等释放基质金属蛋白酶(MMP)，抑制滑膜细胞、内皮细胞、巨噬细胞释放前列腺素，阻止白细胞向炎症部位转移和聚集，同时也通过网络作用使IL-l、IL-6、IL-8相应地减少，因此有抗炎和减缓类风湿关节炎病情恶化发展的作用。rhTNFR-Fc的纯化方法一般使用蛋白质化学中常规使用的蛋白纯化方法，例如使用盐析法、超滤法、等电点沉淀法、电泳法、离子交换层析法、凝胶过滤层析法、亲和层析法等。进行rhTNFR-Fc工业生产时，生产过程中形成了由多个rhTNFR-Fc单体以共价或非共价形式聚合在一起的多聚体(“rhTNFR-Fc多聚体)。从医药的安全性角度出发，药用“rhTNFR-Fc”检定规程中对rhTNFR-Fc多聚体含量有严格要求，因此在制造上，有效去除rhTNFR-Fc多聚体是非常重要的。凝胶过滤层析法常用于去除多聚体，在实验室范围使用较多，但在大规模生产中凝胶过滤层析技术有其很大的局限性，具体局限性主要有以下四点1、处理量小。凝胶过滤层析要达到较好的分离效果，其上样量不能大于柱床体积的5%，上样体积小，所以处理样品量小；2、耗时长。要达到较好的分离效果，其操作流速较慢，线速度一般要小于30cm/h，处理周期长；3、层析柱装填难度大。凝胶过滤层析对柱效要求较高，而大规模层析柱装填要得到装填出高的的理论塔板数和好的对称因子的层析柱会较难；4、样品稀释严重。凝胶层析过程中引起样品的稀释，同时增大了样品体积，增加后续处理难度。综上，使用凝胶过滤层析来去除多聚体，如果要达到较好效果，只能通过增加柱高度和分多次处理样品。这样在生产中不仅大大延长了生产周期，降低了生产效率，而且对装柱要求高，增加了生产技术难度。另外，生产过程处理时间过长可能对目标蛋白的稳定性及生物活性等产生不良影响。所以，在实际大规模生产中需要找到一种更加有效、方便和快速的方法。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种有效、方便和快速的纯化重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)的方法。在本专利技术中，提供了一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)的纯化方法，所述的方法包括步骤(I)将含有rhTNFR-Fc粗品的溶液和疏水层析介质接触，使rhTNFR-Fc上样到疏水层析介质上；和(2)用洗脱缓冲液将rhTNFR-Fc从疏水层析介质上洗脱下来，得到纯化的rhTNFR-Fcο上述提供的纯化方法能够有效的去除多聚体，降低其免疫原性。在上述提供的纯化方法中，所述步骤(I)是将含有rhTNFR-Fc粗品的溶液流过装载有疏水层析介质的层析柱，使rhTNFR-Fc上样到疏水层析介质上；所述上样量是5_20g/L疏水层析介质。在上述提供的纯化方法中，所述的疏水层析介质使用琼脂糖、或聚甲基丙烯酸作为基质，使用苯基配基疏水作用基团、或丁基配基疏水作用基团。在上述提供的纯化方法中，步骤(I)中所述含有rhTNFR-Fc粗品的溶液的电导率为 80_140ms/cm。在上述提供的纯化方法中，步骤(I)中所述疏水层析介质是用平衡缓冲液平衡的；所述平衡缓冲液PH 6-8，电导率为80-140mS/cm ;所述平衡缓冲液选自Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液。在上述提供的纯化方法中，步骤(2)中所述洗脱缓冲液pH 6-8，电导率为15-55ms/cm ;所述洗脱缓冲液选自Tris-HCl缓冲液或磷酸缓冲液。据此，本专利技术提供了一种在实际大规模生产中，可以有效、方便和快速的纯化重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)的方法。附件说明图I显示了实施例I中上样样品SEC-HPLC分析的图谱。图2显示了实施例I中层析洗脱液SEC-HPLC分析的图谱。图3显示了实施例2中上样样品SEC-HPLC分析的图谱。图4显示了实施例2中层析洗脱液SEC-HPLC分析的图谱。图5显示了实施例3中上样样品SEC-HPLC分析的图谱。 图6显示了实施例3中层析洗脱液SEC-HPLC分析的图谱。图7显示了实施例4中上样样品SEC-HPLC分析的图谱。图8显示了实施例4中层析洗脱液SEC-HPLC分析的图谱。具体实施例方式专利技术人经过广泛而深入的研究，发现了一种能方便应用于工业化生产中，且仅实施单步骤工序即能有效去除rhTNFR-Fc多聚体的方法。即将调节好的含有rhTNFR-Fc多聚体的rhTNFR-Fc溶液与用平衡缓冲液平衡化的疏水层析介质相接触，吸附rhTNFR-Fc，再使用洗脱缓冲液选择性地将吸附在层析柱上的rhTNFR-Fc洗脱，而rhTNFR-Fc多聚体因其疏水性较强而保留吸附在疏水层析介质上，以此达到去除rhTNFR-Fc多聚体的效果。在此基础上完成了本专利技术。具体地，本专利技术提供的纯化重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)的方法包括步骤第一步，是将含有rhTNFR-Fc多聚体的rhTNFR-Fc溶液与用平衡缓冲液平衡化的疏水层析介质相接触，疏水层析介质吸附rhTNFR-Fc ；第二步，是使用洗脱缓冲液与疏水层析介质相接触，选择性地将吸附在层析柱上的rhTNFR-Fc洗脱，回收流出组分。本专利技术的方法为适当调节含有rhTNFR-Fc多聚体的rhTNFR-Fc溶液的电导率和pH 值后，将该rhTNFR-Fc溶液与以相同pH值、电导率的缓冲液平衡化的疏水层析介质相接触，通过疏水层析介质吸附rhTNFR-Fc，再使用适当pH值、电导率的缓冲液与疏水层析介质接触选择性洗脱rhTNFR-Fc，进而回收高纯度的rhTNFR-Fc为特征。通过实施这种方法，能够有效去除rhTNFR-Fc多聚体，得到基本不含有rhTNFR-Fc多聚体的高纯度的rhTNFR-Fc。本专利技术所使用的平衡缓冲液和洗脱缓冲液的种类没有特定的限制，优选使用常规的疏水作用层析时使用的Tris-HCl缓冲液和磷酸缓冲液。缓冲液中缓冲成分的浓度一般根据进行疏水作用层析的条件设定。即优选5-50mM，尤其优选10-30mM。平衡缓冲液的pH和电导率设定为能够使rhTNFR-Fc单体吸附本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种重组人II型肿瘤坏死因子受体-抗体融合蛋白(rhTNFR-Fc)的纯化方法，其特征在于，所述的方法包括步骤 (1)将含有rhTNFR-Fc粗品的溶液和疏水层析介质接触，使rhTNFR-Fc上样到疏水层析介质上；和 (2)用洗脱缓冲液将rhTNFR-Fc从疏水层析介质上洗脱下来，得到纯化的rhTNFR-Fc。2.如权利要求I所述的纯化方法，其特征在于，所述步骤(I)是将含有rhTNFR-Fc粗品的溶液流过装载有疏水层析介质的层析柱，使rhTNFR-Fc上样到疏水层析介质上。3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述上样量是5-20g/L疏水层析介质。4.如权利要求1-3任一所述的纯化方法，其特征在于，所述的疏水层析介质使用琼脂糖、或聚甲基丙烯酸作为基质，使用苯基配...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈智胜，
申请(专利权)人：上海赛金生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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