基于RNAi技术的抗虫制剂及方法技术

本发明专利技术涉及基于RNAi技术的抗虫制剂及方法。揭示了一些对于防治鳞翅目昆虫有用的靶标基因(片段)，基于这些靶标基因的核酸序列制备核酸抑制物或表达核酸抑制物的宿主法，可有效地杀灭鳞翅目昆虫。本发明专利技术还揭示了所述核酸抑制物或表达核酸抑制物的宿主的施用方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
和农业应用领域；更具体地，本专利技术涉及基于RNAi技术防治鳞翅目害虫的靶标基因，描述了将靶标基因合成为双链RNA制剂并直接应用于鳞翅目害虫田间防治的方法。
技术介绍
亚洲玉米螟(Ostrinia furnacalis Guen6e)是重要世界性农业害虫,主要危害玉米、高粱、向日葵等重要的粮食经济作物，目前对亚洲玉米螟的防治，仍然是以化学防治为主，但是其对生态环境及粮食安全生产造成了巨大的损害。 化学防治技术的诸多问题已经使得人们不得不寻求更好的害虫治理办法，生物防治虽然可以起到一定的防治作用，但是由于其见效缓慢，效果不明显，受环境影响较大而得不到大众认可，转基因植物可以有效地防治害虫，但是随着单一转基因作物的长期种植，会诱导害虫抗性增加，非靶标害虫危害增加，而且转基因植物安全性目前还存在一些争议，制约着该技术的发展。RNAi现象自从1991年发现以来迅速发展，研究表明，通过特异基因的RNAi，可以达到定向干涉物种的靶基因，出现某些生理现象，达到研究基因功能的目的，同时，这种现象有着极高的特异性，即同源基因的特定片段对不同物种所发挥的干涉效果并不相同，因此是一种理想的害虫种类特异的防治体系。目前，利用RNAi技术进行害虫防治已有报道，Baum等(2007)证明v-ATPase对玉米根萤叶甲(Western corn rootworm WCR, Diabrotica virgifera LeConte)有致死效果，可以用于田间防治；同年，Mao等通过将P450的dsRNA导入棉花中，可以导致棉铃虫(cotton bo I lworm Helicoverpa armigera)死亡；Tian证实通过饲喂的方法可以导致甜菜夜蛾(Spodoptera exigua Hiibner)的死亡,一系列的综述文章都表明，RNAi技术作为一种新型的害虫防治方法是完全可行的。但是，之前的研究也表明，基于RNAi技术的害虫防治还有很多问题需要解决，如I)如何快速高通量的发掘靶标基因；2)如何简便的应用于田间生产；3)抗性问题；4)安全性问题等等。要想利用RNAi技术进行害虫防治，就需要解决以上问题，首先需要获得足够多的、有效的靶标基因，这样，大量的靶标基因通过不同的组合方式，不同的时期使用不同的基因进行防治，可有效地避免害虫抗性的出现。因此，利用RNAi技术的害虫防治集中在靶标基因的获得以及如何方便地应用于田间这两个急需解决的问题，本专利技术旨在解决这些问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供基于RNAi技术的抗虫制剂及抗虫方法。在本专利技术的第一方面，提供一种分离的多肽，该多肽选自下组(a) SEQ ID NO :43_52任一所示氨基酸序列的多肽；(b)将SEQ ID NO :43-52任一所示氨基酸序列经过一个或多个(如1_20个；较佳地1-15个；更佳地1-10个；更佳地1-5个；如3个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。 在本专利技术的另一方面，提供一种分离的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组(a)编码如前所述多肽的多核苷酸；(b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。在另一优选例中，所述的多核苷酸，它包含一核苷酸序列，该多核苷酸选自下组的一种(a) SEQ ID NO :1-10, SEQ ID NO :33-42、SEQ ID NO :53_60，任一所示序列的多核 苷酸，或互补序列；(b)与(a)限定的序列在严格条件下杂交的任一多核苷酸或互补序列，其中有害生物对包含至少一条与所述多核苷酸互补的链的dsRNA的摄取，抑制所述有害生物的生长;(c)与(a)限定的序列具有至少70% (优选至少75%、80%、85%、90%，更优选至少95%、96%、97%、98%、99% )以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列，其中有害生物对包含至少一条与所述多核苷酸互补的链的dsRNA的摄取，抑制所述有害生物的生长;(d)包含(a)限定的任一所示序列之至少17-21个连续核苷酸的序列或互补序列，其中有害生物对包含至少一条与所述多核苷酸互补的链的dsRNA的摄取，抑制所述有害生物的生长在本专利技术的另一方面，提供一种载体，它含有权所述的多核苷酸中的一种、二种或多种。在本专利技术的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或其基因组中整合有所述的多核苷酸中的一种、二种或多种。在本专利技术的另一方面，提供所述的多核苷酸的用途，用于作为制备特异性干扰有害生物基因表达或抑制有害生物生长的干扰分子的抑制或沉默靶标，所述的有害生物基因选自LIM蛋白I基因、肌球蛋白3轻链基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶Cl基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶C3基因、羟丁酸脱氢酶基因、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂I基因、脂肪酸结合蛋白I基因、羧肽酶4基因。在本专利技术的另一方面，提供一种核酸抑制物，选自(a)以所述的多核苷酸作为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，其中有害生物摄取所述核酸抑制物，抑制所述有害生物的生长；或(b)以有害生物基因作为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，其中有害生物摄取所述核酸抑制物，抑制所述有害生物的生长，所述的有害生物基因选自LIM蛋白I基因、肌球蛋白3轻链基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶Cl基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶C3基因、羟丁酸脱氢酶基因、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂I基因、脂肪酸结合蛋白I基因、羧肽酶4基因；或(c)能表达或形成(a)、(b)所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。在另一优选例中，所述的核酸抑制物是所述的多核苷酸表达产生的dsRNA，其中有害生物摄取所述dsRNA，抑制所述有害生物的生长。在另一优选例中，所述的dsRNA，其具有如下结构本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
2011.03.18 CN 201110067359.71.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组 (a)SEQ ID NO :43-52任一所不氨基酸序列的多肽； (b)将SEQID NO 43-52任一所示氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽。2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组 (a)编码如权利要求I所述多肽的多核苷酸； (b)与多核苷酸(a)互补的多核苷酸。3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该多核苷酸选自下组的一种 (a)SEQ ID NO :1-10,SEQ ID NO :33-42、SEQ ID NO :53_60，任一所示序列的多核苷酸，或互补序列； (b)与(a)限定的序列在严格条件下杂交的任一多核苷酸或互补序列，其中有害生物对包含至少一条与所述多核苷酸互补的链的dsRNA的摄取，抑制所述有害生物的生长； (c)与(a)限定的序列具有至少70%以上的序列一致性的任一多核苷酸或互补序列，其中有害生物对包含至少一条与所述多核苷酸互补的链的dsRNA的摄取，抑制所述有害生物的生长； (d)包含(a)限定的任一所示序列之至少17-21个连续核苷酸的序列或互补序列，其中有害生物对包含至少一条与所述多核苷酸互补的链的dsRNA的摄取，抑制所述有害生物的生长。4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2或3所述的多核苷酸中的一种、二种或多种。5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2或3所述的多核苷酸中的一种、二种或多种。6.权利要求2或3任一所述的多核苷酸的用途，用于作为制备特异性干扰有害生物基因表达或抑制有害生物生长的干扰分子的抑制或沉默靶标，所述的有害生物基因选自LIM蛋白I基因、肌球蛋白3轻链基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶Cl基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶C3基因、羟丁酸脱氢酶基因、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂I基因、脂肪酸结合蛋白I基因、羧肽酶4基因。7.—种核酸抑制物,选自 (a)以权利要求2或3任一所述的多核苷酸作为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，其中有害生物摄取所述核酸抑制物，抑制所述有害生物的生长；或 (b)以有害生物基因作为抑制或沉默靶标的dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA，其中有害生物摄取所述核酸抑制物，抑制所述有害生物的生长，所述的有害生物基因选自LIM蛋白I基因、肌球蛋白3轻链基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶基因、胰凝乳蛋白酶样蛋白酶Cl基因、胰凝乳蛋白酶样丝氨酸蛋白酶C3基因、羟丁酸脱氢酶基因、Kazal型丝氨酸蛋白酶抑制剂I基因、脂肪酸结合蛋白I基因、羧肽酶4基因；或 (c)能表达或形成(a)、(b)所述dsRNA、反义核酸、小干扰RNA、微小RNA的构建物。8.如权利要求7所述的核酸抑制物，其特征在于，所述的核酸抑制物是权利要求2或3所述的多核苷酸表达产生的dsRNA，其中有害生物摄取所述dsRNA，抑制所述有害生物的生长。9.如权利要求8所述的核酸抑制物，其特征在于，所述的dsRNA，其具有如下结...

【专利技术属性】
技术研发人员：李海超，苗雪霞，张浩，王玉冰，黄勇平，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：