本发明专利技术涉及一个海带雌配子体特异性分子标记FSML-1488的染色体定位方法，包括以下步骤：（1）带有目标片段FSML-1488质粒DNA的制备；（2）海带配子体染色体的制备；（3）探针的制备；（4）荧光原位杂交。本发明专利技术优点在于：本发明专利技术利用各种工具酶，如离析酶、鲍鱼酶、纤维素酶、果胶酶等的优化配合以获得海带孢子体和配子体原生质体的基础上，制备高质量的染色体，突破FISH技术在藻类学研究中的技术“瓶颈”，成功地将一个长为1488bp的海带雌配子体特异性FSML-1488分子标记定位在染色体上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地说，是有关海带雌配子体一个特异性FSML-1488(female-specific marker of Laminaria japonica Areschノ分ナ不不I己仕染色体上白勺定n。
技术介绍
悔荀1ySaccharinajaponica (Areschoug) C. E. Lane, C. Mayes, Druehl et G.ff. Saunders, comb. nov. ^^{Laminaria japonica Aresch.)隶偶揭藻| J (Phaeophyta)、海带目(Laminariales)，是我国海水养殖业中重要的经济海藻之一。海带生活史具有明显的异型世代交替。孢子体(即人们通常所食用的主要部分)成熟时，带片上单室孢子囊的孢子母细胞经过减数分裂及多次分裂，产生32个单倍性侧生双鞭毛的同型游动孢子；它们在释放后不久附着于基质上，当生长环境适宜吋，分别发育成雌、雄配子体，且性别比为I: I (Schreiber, 1930)。这个性别比结果预示着海带可能存在着类似高等植物単性花那样的性别决定系统。Evans (1963, 1965)对掌状海带(Z.)等几物种进行染色体研究,在雌配子体中发现两个较小和一个较大的染色体，并推测那个较大的染色体可能是它们的性染色体。另外，大量単性生殖的实验结果(戴继勋和方宗熙，1976 ;方宗熙等，1978 ；Motomura,1991 ;戴继励等，1992 ；Lewis et al. , 1993)证实,海带雌配子体经无融合单性生埴产生的孢子体能形成孢子囊和游动孢子，且这些游动孢子能正常发育均成为雌配子体，说明海带普遍存在着“孤雌生殖”现象。根据这些研究結果，方宗熙等(1978)推测海带存在类似X/Y性别决定系统，其中二倍性的孢子体为XY型，而单倍性的雌、雄配子体分别为X型和Y型。但遗憾的是，戴继勋和方宗熙(1977)、Yabu & Yasui (1991)以及刘宇等(2012)在利用细胞学方法观察海带染色体时，虽证实海带染色体小且雌配子体(大小在O. 78-2. 61 μ m之间)稍微大雄配子体(大小在O. 57-2. 17 μ m之间)，它们多呈短杆状或点状，但这些报道都显示在雌配子体中均没有发现到显著的大型性染色体。据此可以推测，海带可能存在性染色体，但它与常染色体在形态上没有明显的差异。分子标记已广泛应用于高等植物的性别鉴定(Jiang & Sink, 1997; Gunter etal. , 2003a; 2003b; Stehlik & Blattner, 2004; Xu et al. , 2004; Yakubov et al.,2005; Chaves-Bedoya & Nunez, 2007; Li et al. , 2010; Samantaray et al. , 2010)。但至今鲜有藻类性别相关分子标记的报道。Sim et al. (2007)认为随机扩增多态性DNA(random amplified polymorphic DNA, RAPD)技术可用于弓长氏'江萬changii)雌、雄株及孢子体的鉴定。Martinez et al. (1999)利用RAPD技术从细江蓠((Jraci/ariagracilis)中分别获得I个雌性相关PCR标记和2个雄性相关分子标记。最近，通过微卫星引物筛选，Shan & Pang (2010)从裙带菜(fet/aria pinnatifida)キ敬篇一个与雌配子体相关的分子标记。本课题组所根据地钱polymorpha L. )Y染色体特异序列(GenBank登录号ΑΒ069714)设计引物，从海带雌配子体中扩增出一条差异片段，并在国际上率先将该片段成功转化为ー个命名为FRML-494的SCAR标记(Liu et al.，2009);但这些性别相关分子标记能否特异地定位于染色体上，将直接影响到这些标记在海带无性繁殖系育苗与育种方面有关雌、雄配子体的鉴定以及在海带配子体性别分化、性别染色体等基础理论的深入研究。突光原位杂交(fluorescencein situ hybridization,FISH)技术是建立在原位杂交(i/ situ hybridization)技术的原理与操作方法基础上(Gall and Pardue, 1969;John et al. , 1969)，首先在哺乳动物的研究中被开发出来(Pinkel ei a人，1986)，它是利用荧光物质标记好的DNA或RNA探针与细胞染色体的核酸进行杂交,检测后者在细胞内的存在及其数量和结构改变的方法。自从Le et a人(1989)及Schwarzacher et al. (1989) 在植物中成功应用FISH技术后，这种功能強大的手段已广泛运用于高等植物基因组分析中(參见综述 Lavania, 1998; Jiang & Gill, 2006; Schwarzacher & Heslop-Harrison,2011)，因为它能够使目标DNA序列无论在有丝分裂还是在減数分裂的染色体上，都能进行物理绘图。因而可用于高等植物性别相关基因或DNA标记的定位(Ueda & Tanaka，1995;Mariotti et al. , 2009)及性染色体的鉴定(Shibata et al. , 1999; 2000 ;Hobza etal. , 2004; Lan et al. , 2006)等研究。但FISH技术至今还没有用于目标DNA序列在藻类染色体上的定位。中国专利文献CN101280339B公开了ー个能辨别海带雌配子体的SCAR分子标记，可以对海带配子体性别进行快速有效的鉴定，也可对单性海带孢子体亲本来源及其后代的性别进行鉴定。中国专利文献CN101280340B公开了能辨别海带雌、雄配子体的特异分子标记，可以对海带配子体性別、単性生殖海带孢子体亲本来源及其后代性别进行鉴定，也可以在细胞核分子水平上对海带性别分化进行研究。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的不足，提供一个海带雌配子体特异性分子标记FSML-1488的染色体定位方法。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案是一个海带雌配子体特异性分子标记FSML-1488的染色体定位方法，包括以下步骤 Cl)带有目标片段FSML-1488质粒DNA的制备通过CTAB法提取海带配子体DNA后，利用PCR技术扩增到长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488的片段，然后TA克隆后转化至大肠杆菌中，最后提取质粒获得目标片段质粒DNA，所述的目标片段FSML-1488的序列为 SEQ ID NO. 5 ； (2)海带配子体染色体的制备利用混合酶液，即纤维素酶、果胶酶、离析酶及鲍鱼酶，处理海带配子体细胞，以DAPI染色，获得分裂相比较好的高质量染色体； (3)探针的制备对提取的质粒获得目标片段FSML-1488质粒DNA利用切ロ平法进行緑色生物素标记探针； (4)荧光原位杂交按照荧光原位杂交的常规方法进行雌配子体特异性FSML-1488分子标记的染色体定位。所本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一个海带雌配子体特异性分子标记FSML-1488的染色体定位方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)带有目标片段FSML-1488质粒DNA的制备通过CTAB法提取海带配子体DNA后，利用PCR技术扩增到长为1488 bp的雌配子体特异性FSML-1488的片段，然后TA克隆后转化至大肠杆菌中，最后提取质粒获得目标片段质粒DNA，所述的目标片段FSML-1488的序列为 SEQ ID NO. 5 ； (2)海带配子体染色体的制备利用混合酶液，即纤维素酶、果胶酶、离析酶及鲍鱼酶，处理海带配子体细胞，以DAPI染色，获得分裂相比较好的高质量染色体； (3)探针的制备对提取的质粒获得目标片段F...
【专利技术属性】
技术研发人员：周志刚，刘宇，谷俊刚，毕燕会，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。