本发明专利技术涉及一种抗氧化肽及其制备方法。本发明专利技术利用花生粕及自制的成曲酶，通过酶法水解，得到花生粕酶解液，再利用超滤膜、凝胶过滤色谱及反相高效液相色谱对其进行分离纯化得到一种新的抗氧化肽产品，并测定其氨基酸序列。该产品的氨基酸序列为Tyr-Gly-Ser，分子量为325.3Da，具有很强的抗氧化作用，氧自由基吸收能力是还原型谷胱甘肽的4倍，而且该肽具有分子量小、可被人体直接吸收的特点，因此可以广泛应用于食品、保健品及化妆品等领域。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及食品生物
，具体涉及ー种抗氧化肽的制备方法。
技术介绍
自从英国Harman于1956年提出自由基理论以来,人们逐步认识到人体许多慢性 疾病如糖尿病、心血管疾病、神经组织退化紊乱、癌症及衰老都与体内氧化产生的自由基有 关，因而抗氧化剂的研究越来越被人们所关注。传统使用的抗氧化剂大多为合成抗氧化剂， 如ニ叔丁基羟基甲苯(BHT)，叔丁基羟基茴香醚(BHA)，由于廉价而且具有很强的抗氧化能 カ而被广泛使用，但是由于其对人体健康构成潜在的危害而被限制使用。因此，寻找和开发 安全、无毒的天然抗氧化剂，已成为当今社会的研究热点。天然抗氧化肽是存在于动植物体中具有抗氧化活性的肽类，它具有清除自由 基、螯合金属离子、猝灭单线态氧、分解过氧化物及抑制脂质过氧化等功效，易被人体吸 收，无毒副作用，营养和加工特性良好，因此在人类食品和药品中具有巨大的开发前景。 目前也有很多学者采用酶解的技术从植物或者动物组织中制备得到活性很强的抗氧化 肽。专利技术申请专利(申请号201010141974. 3)公开了 一系列的胶原蛋白抗氧化肽，具有 如下之一的氨基酸序列(I) Hyl-Cys ； (2) Gln-Gly-Ala-Arg ； (3) Leu-Gln-Gly-Met ； (4) Leu-Gln-Gly-Met-Hyp,该产品抗氧化作用很强，不仅可以替代BHT等用作食品的添加剂， 而且可以作为活性功能性成分，而且具有分子量小的特点，易被消化道直接吸收。专利技术申 请专利(申请号200510009423.0)公开了通过将蜂王浆用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶进行酶 处理，可以获得具有和维生素E同等強度的强抗氧化能力的三种抗氧化肽，氨基酸序列为 (I)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu ； (2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；(3)Ser-Leu-Pro-Ile -Leu-His-Glu-Trp。花生柏是花生仁经过榨油后的副产物，含有丰富的蛋白质，但由于在榨油过程中 经历了高温压榨和溶剂浸提的过程，导致花生蛋白严重变性，色泽和气味恶化，目前主要用 作饲料或肥料。但是我国毎年有几百万吨的花生柏，来源广泛、价格低廉，因此如何充分开 发利用花生柏中的蛋白质资源，提高其附加值，是植物蛋白资源综合利用的重要环节。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供ー种原料来源丰富廉价，且抗氧化活性很强的抗氧化肽及 其制备方法，该抗氧化肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Ser，具体技术方案如下。ー种抗氧化肽的制备方法，包括如下步骤(I)成曲酶的制备将10 30g麸皮，5 20g花生柏，0. 01 0. Ig氯化钙和15 50g 去离子水混合均匀；在高压蒸汽灭菌锅中100 121°C下杀菌15 30min，冷却至38°C，接 种米曲霉，在培养箱28 32°C培养48 72h ;加入200mL去离子水，在30 50°C水浴中 搅拌1 311，在0 4で下5000 10，000 X ^ 离心20 30min，取上清液，冷冻干燥得成 曲酶。CN 102660615 A书明说2/4页(2)花生柏酶解物的制备将花生柏与水按质量比1 :4 1 :8混合，加入以花生柏 蛋白质量计0. 4 1%的成曲酶，在50 55°C酶解4 24h ;85 95°C下灭酶15 30min， 离心，取上清液，得到花生柏酶解液；(3)抗氧化肽的分离纯化将花生柏酶解液通过截留分子量为3000Da的超滤膜，滤去 大分子，取透过液，冷冻干燥成粉末；再用凝胶过滤色谱柱G-15进行分离纯化，用去离子水 以0. 6 2 ml/min的流速进行洗脱，检测波长为214nm，测定各洗脱峰对应组分的抗氧化活 性，收集活性最高的组分，然后冷冻干燥成粉末；(4)最后用反相高效液相色谱法进一步纯化，色谱柱为XBridge pre C18柱(5 y m， 10 X 150mm; Waters, USA)，流动相为A相和B相，洗脱程序为0_4min内采用的流动相中 A与B体积比为5:95-10:90, 4_8min内采用的流动相中A与B体积比为10:90-30:70, 8-12min内采用的流动相中A与B体积比为30:70-50:50，12_30min内采用的流动相中A与 B体积比为50:50，流速为2ml/min，检测波长为214nm。测定各组分的抗氧化活性，收集活 性最高的组分，冷冻干燥，得到目标肽。所述A相为甲醇，B相为质量浓度0. 1%的三氟乙酸水溶液。用电喷雾串联质谱法测定肽的氨基酸序列为Tyr-Gly-Ser，分子量为325. 3Da。在本专利技术中，米用ORAC (Oxygen radical absorbance capacity,氧自由基吸收 能力)法来测定抗氧化肽的活性。该方法现已经成为美国农业部、美国卫生院、FDA评价食 品抗氧化能力的重要标准。欧洲、日本等国家的食品、功能食品行业也普遍采用0RAC作为 抗氧化能力的重要评价标准，是目前评价体外抗氧化能力最权威性的方法。基于0RAC反应 在75 mmol -L _1磷酸盐缓冲液(pH =7.4)环境中进行，FL (荧光素钠盐)、AAPH (自由基产 生剂)、标准抗氧化物质Trolox (维生素E水溶性类似物)以及待测样品均用该缓冲液溶解 和稀释。具体测定操作为在96孔板各微孔中分别加入待测样品20 yl，FL (终浓度为70 nmol *L ―1 ) 120iU，在37°C下预置15 min后，用多道移液器迅速在各孔中加入AAPH (终 浓度为12 mmol-L 1 )60 yl启动反应，并将微孔板置于荧光分析仪中在37°C下以激发波 长485 nm,发射波长528 nm进行连续测定，每1 min测定一次各孔突光强度，测定120min, 荧光强度分别记为fo，f\，f2* * f120O将记录的各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据126 ￡fn与初始荧光强度fo相比，折算成相对荧光强度，并根据公式本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种抗氧化肽的制备方法，其特征在于该方法步骤如下 (1)成曲酶的制备将10 30g麸皮，5 20g花生柏，O.01 O. Ig氯化钙和15 50g去离子水混合均匀；在高压蒸汽灭菌锅中100 121°C下杀菌15 30min，冷却至38°C，接种米曲霉，在培养箱28 32°C培养48 72h ;加入200mL去离子水，在30_50°C水浴中搅拌l_3h，在0-4°C下5000 10，000 X g·离心20 30min，取上清液，冷冻干燥得成曲酶； (2)花生柏酶解物的制备将花生柏与水按质量比I:4 I :8混合，加入占花生柏蛋白质量O. 4% 1%的成曲酶，在50 55°C酶解4 24h ；85 95°C下灭酶15 30min，离心，取上清液，得到花生柏酶解液； (3)抗氧化肽的分离纯化将花生柏酶解液通过截留分子量为3000Da的超滤膜，滤去大分子，取透过液，冷冻干燥成粉末；再用Sephadex G_15凝胶柱进行分...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵谋明，郑淋，任娇艳，苏国万，崔春，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：
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