本发明专利技术涉及通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞来制备人胰岛素类似物的方法，其中所述前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌大量正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及在酵母中制备成熟人胰岛素类似物的方法。
技术介绍
胰岛素是在胰岛P细胞中产生的多肽激素。有活性的胰岛素分子是由通过两个二硫键相连的B-链和A-链组成的双链分子。胰岛素以结构为B-C-A的前体分子胰岛素原形式合成，其中C-肽链将B-链的C-末端氨基酸残基与A-链的N-末端氨基酸残基相连。成熟的双链胰岛素通过在位于与A-和B-链的接点处的碱性氨基酸残基对处切割C-肽形成。A-和B-链通过分别位于A7和B7以及A20和B19 Cys残基之间的两个二硫键保持在一起。此外，生物学活性的胰岛素分子还在A6和All位Cys残基之间有一个内部二硫键。在开发出重组DNA技术之后，已经描述了许多在基因修饰宿主细胞中生产胰岛素及其前体的方法。因此在例如 Frank, B. H. , Pettee, J. M. , Zimmerman, R. E. & Burck, P. J. In Peptides Synthesis-Structure-Function. Proceedings of the Seventh AmericanPeptide Symposium(D. H. Rich 和 E. Gross，eds) Pierce Chemical Company,p.729 (1981)中公开了从大肠杆菌(E.coli)中制备胰岛素的方法。由于大肠杆菌不具备将所表达的多肽进行折叠的细胞机器且不确立在成熟胰岛素中连接A-和B-链的二硫键，所以，该策略包括了许多体外加工步骤，比如在重折叠过程中体外确立二硫键以及随后的C-肽切割。与大肠杆菌形成对比，真核生物包含折叠和确立二硫键所必需的机器，且由此看来似乎是用于在基因修饰生物中生产成熟胰岛素的好候选者。美国专利US 4，914，026公开了一种在酵母中生产成熟胰岛素的方法，其通过下述实现，在酵母宿主细胞中插入与酵母a-因子前导序列相连的人胰岛素原基因并在一定条件下使转化酵母细胞在营养培养基中生长，由此表达和分泌成熟形式的胰岛素原。Thim 等人，Proc Natl. Acad. Sci. USA,第 83 卷，第 6766-6770 页，公开了人膜岛素原以及多种带有经过修饰的C-肽的胰岛素前体的表达，所述经过修饰的C-肽例如 RREAENLQKR(SEEQ ID NO : I)、RREAPLQKR(SEQ ID NO :2)、RREALQKR(SEQ IDNO :3)、KREALQKR(SEQ IDNO 4) RRLQKR(SEQ ID NO :5)。SEQ ID NO :5 还公开于 Thim 等人，FEBSLetters，第 212 卷，第 2 期，第 307-312 页。此外，WO 97/03089公开了式为BZA的胰岛素前体的表达，其中B和A是通过至少一个二硫键相连的人胰岛素A和B肽链，Z是包含至少一个蛋白酶剪切位点的多肽，例如KREQKLISEEALVDKR(SEQ ID NO :6)。然而，所公开的胰岛素前体仅在培养基中产生微量分泌的成熟胰岛素。 欧洲专利申请0163529A、PCT专利申请号WO 95/02059和W090/10075公开了基于胰岛素或胰岛素类似物前体在酵母中的表达来制备胰岛素和胰岛素类似物的方法，这些胰岛素或胰岛素类似物前体在从发酵液体培养基中初始回收后被酶促转化为成熟胰岛素或胰岛素类似物。这些前体分子包含特定的经过修饰的C-肽，且还包含胰岛素B-链的N-末端延伸。经过修饰的C-肽和可能的B-肽N-末端延伸被设计成不在酵母中细胞被切割，且由此前体作为单链肽分泌，其中A-和B-链仍然通过经过修饰的C-肽连接但具有正确定位的二硫键。之后通过许多随后的体外酶促步骤以切割C-肽和可能的N-末端延伸得到成熟的胰岛素或胰岛素类似物产物。这些酶促步骤是耗时的，常常是昂贵的，并且导入随后在进一步的下游加工步骤比如昂贵的层析步骤等中必须被除去的额外杂质。美国专利号6，348，327中公开了在不能天然形成分泌颗粒的基因工程改造的动物细胞中制备成熟胰岛素的方法。本专利技术的目的是开发能够分泌完全加工的成熟人胰岛素类似物的真菌菌株，由此避免昂贵且费时的下游纯化方法步骤
技术实现思路
一方面，本专利技术涉及通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞制备成熟人胰岛素类似物的方法，其中所述前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。根据本专利技术的人胰岛素类似物在真菌细胞内将作为单链前体表达，且将在该细胞内被切割，并以成熟、双链人胰岛素类似物分泌，无需进一步的体外加工。位于连接肽与胰岛素分子A-和B-链各接点处的切割位点可以相同或不同，但通常是相同的，且在一种实施方案中，位于与A-和B-链接点处的切割位点均为Kex2切割位点。在另一种实施方案中，切割位点为Ypsl位点。连接肽将具有经过最优化以确保在真菌细胞内发生切割以分泌正确成熟化的胰岛素类似物多肽的氨基酸组成。在本专利技术的一种实施方案中，对于与A-链接近的切割位点倒数第二位的氨基酸残基选自 Phe、Leu、lie、Tyr> Trp> Val、Met 和 Ala。在本专利技术的另一种实施方案中，连接肽在对于与A-链接近的切割位点倒数第二位将包含 Leu、lie、Tyr> Arg、Lys> His、Pro、Phe、Tyr> Trp> Met、Val 或 Ala 氨基酸残基。在本专利技术的又一种实施方案中，连接肽在该位置将包含Leu或Ile氨基酸残基。我们还发现，相同位置的氨基酸残基不应当是Asp、Glu或Gly。人胰岛素中C-肽的大小是35个氨基酸残基。因此在本专利技术的一个方面，该连接肽为约与天然C-肽相同长度。在一种实施方案中，连接肽将为2-35、2-34、2-33、2-31、2-30、2-29、2-28、2-27、2-26、2-25、2-24、2-23、2-22、2-21、2-20、2-19、2-18、2-17、2-16、2-15、2-14、2-13、2-12、2~11 >2~10>2~9>2~8>2~7>2-6>2-5>2-4 或 2-3 个氛基酸残基。在又一种实施方案中，连接肽将为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5 或 3-4 个氛基酸残基。在又一种实施方案中，连接肽将由2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3031、32、33、34 或 35 个氨基酸残基组成。真菌细胞将分泌大量正确加工的人胰岛素类似物，且在一种实施方案中，该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约50mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。在另一种实施方案中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
2005.08.16 EP 05107513.31.通过培养含有编码人胰岛素类似物前体的DNA载体的真菌细胞来制备成熟人胰岛素类似物的方法，其中所述前体含有连接肽，在所述连接肽两侧与胰岛素肽A-和B-链的两个接点处分别带有切割位点，所述切割位点在真菌细胞内被切割，从而允许细胞向培养基中分泌正确加工的成熟、双链人胰岛素类似物。2.根据权利要求I的方法，其中所述切割位点是Kex2切割位点。3.根据权利要求I或2的方法，其中所述连接肽中对于与A-链接近的切割位点倒数第二位的氛基酸残基选自 Leu> lie、Tyr> Arg、Lys> His、Pro、Met、Val、Ala 和 Phe。4.根据权利要求3的方法，其中所述氨基酸残基选自Leu和He。5.根据权利要求1-4的方法，其中所述连接肽的大小为3-35、3-34、3-33、3-31、3-30、3-29、3-28、3-27、3-26、3-25、3-24、3-23、3-22、3-21、3-20、3-19、3-18、3-17、3-16、3-15、3-14、3-13、3-12、3-11、3-10、3-9、3-8、3-7、3-6、3-5 或 3-4 个氨基酸残基。6.根据权利要求I的方法，其中所述胰岛素类似物具有在A8、BIO,A18和A14位中至少之一的突变。7.根据权利要求6的方法，其中所述突变选自Asp、Glu、His、Gln和Arg。8.根据权利要求6的方法，其中所述胰岛素类似物B10Glu、A8His、A14Glu人胰岛素。9.根据权利要求1-8的方法，其中该真菌细胞能够向培养基中分泌至少约20至约50mg/L正确加工的成熟双链人胰岛素类似物。10.根据权利要求1-8的方法，其中该真菌细胞能够...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·S·安德森，L·H·克里斯滕森，
申请(专利权)人：诺沃诺迪斯克有限公司，
类型：发明
国别省市：
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