基因组长片段删除系统及其应用技术方案

本发明专利技术公开了基因组长片段删除系统，由特异剪切目的基因2个靶序列的2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN组成，作用于基因组后能够对目的基因实现长片段删除；还公开了该删除系统的应用，使用方便，能够获得遗传变异大的品种，为育种提供丰富的遗传资源，具有广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是涉及基因组长片段删除系统，还涉及基因组长片段删除系统的应用。
技术介绍
家蚕是重要的经济昆虫和鳞翅目昆虫模式生物，在我国已经有5000多年的饲养和驯化历史。蚕丝业在历史上一直与农并茂，为中华民族经济的发展和文化的弘扬都做出了巨大贡献。蚕丝拥有雍容典雅的光泽、轻盈舒适的触感、良好的衣料悬垂性和曲线性、适中的吸水性以及对人体肌肤的亲和性等固有的优良特性，长久以来都深受广大消费者的喜爱，蚕丝也因此而被誉为“纤维皇后”。目前我国丝绸エ业年总产值达1350亿元，占纺织エ业总产值的10%以上；茧丝产量和出ロ量分别占世界总额的70%和80%以上，年创汇超过50亿美元，是在国际市场上处于绝对优势的特色产业。全国共有种桑养蚕农户2000多万户，遍布20余个省区。蚕业是目前我国农村经济中的重要组成部分，其年出口创汇额在农产品中位居前列，是农民收入的重要来源。蚕丝产业在解決“三农”问题，特别是增加农民收入、调整农村产业结构上发挥着越来越重要的作用。然而，作为ー个古老的传统产业，蚕桑丝绸生产技术与水平最近60年来都处于ー个平台期。蚕品种的强健性、絹丝品质、产量等主要经济性状差等品种资源问题一直没有取得重大的突破，蚕丝服装易发黄、变皱等固有缺陷没有得到根本的解決。品种资源更新远远 跟不上生产需要，蚕丝业整体生产效益低下。这主要是因为1)经过上百年的挖掘，基于传统育种手段的增产潜力已经发挥到极致，加之自然条件的特殊性和局限性，目前已很难突破品种资源本身的局限。现存的家蚕品种虽然种类和数量颇多，但是其遗传背景単一，相互之间的经济性状和生物学性状并没有显著的差异。家蚕品种经过百年更迭，在经济性状和生物学性状上都没有显著的改进。2)作为纺织纤维，蚕丝因其价格昂贵使得众多消费者望而止步，加之蚕丝具有易发黄、起皱的缺点，使其在各种纺织纤维中并不占有很大的市场份额。在蚕丝产业几乎停滞不前的近几十年中，棉、毛等纺织纤维的研究和利用进展良好，各种人造纤维异军突起，对蚕丝产业造成了比较大的冲击。3)长久以来，人类驯化和饲养家蚕的主要目的是缫丝织绸，所以现存的家蚕品种几乎都是千篇一律的多丝量品种，其茧丝的成分和特性基本上没有什么区别。在蚕业科技日新月异的今天，蚕丝越来越多的作为ー种多功能的生物材料而被重新认识。家蚕是研究鳞翅目昆虫的理想模式生物和重要的生物反应器。家蚕遗传学和生理学的早期研究成果为昆虫信息素、激素、解剖学、生理学和遗传学等方面的基础发现做出尤为重要的贡献；在家蚕基因组框架图、家蚕基因组精细图、家蚕基因芯片和遗传变异图相继解析之后，家蚕基因组学和功能基因组学研究在现代昆虫生物学研究中也起着举足轻重的作用。作为合成和分泌丝蛋白的唯一器官，家蚕丝腺是昆虫中蛋白质合成能力最強的生物器官，一头家蚕可生产纯蛋白质O. 5g以上。无论是在基础研究，还是在药物、化妆品开发领域，提取或表达纯化的蛋白都扮演着极其重要的角色。饲养ー头蚕的成本不足I角钱，却能吐O. 5g的丝蛋白，而如果能用基因工程手段让家蚕吐出O. 5g纯蛋白，这对于蚕丝产业、甚至生物产业都将产生革命性的推动作用。也正是这ー奇特的生物学现象和应用前景吸引着众多生物学家自分子生物学发端以来就长期致カ于家蚕丝蛋白的表达调控和家蚕生物反应器的开发。要突破传统育种的局限，获得品种选育的革命性突破；彻底克服蚕丝的固有缺陷，恢复蚕丝的纺织纤维市场中生 机；开发新型多功能蚕丝材料，促进单ー的蚕丝产业向更为广阔的非絹丝产业扩展，这些都是现代蚕业中亟须解决的关键问题。在分子农业时代，这些问题的解决离不开对家蚕重要经济性状相关基因的功能解析和遗传改造。要最大程度的发挥家蚕在鳞翅目昆虫研究中的模式作用，推动家蚕生物反应器的进ー步开发和应用，也离不开转基因、基因组编辑和遗传改造等重要的分子工具。尽管转基因和RNAi等目前广泛应用的分子改良工具在家蚕中已经得到了较好的应用，但是能直接对家蚕内源基因进行编辑和改造的技术还未见报道，更没有长片段基因组序列删除的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的之ー在于提供基因组长片段删除系统，该删除系统能够为对目的基因进行编辑，删除目的基因的长片段，提供遗传资源丰富的物种，技术方案为 基因组长片段删除系统，所述基因组长片段删除系统由特异剪切目的基因内2个靶序列的2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN组成；所述2个靶序列为位于所述目的基因5’端的第一靶序列和位于所述目的基因3’的第二靶序列；所述2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN由转录激活子样效应因子核酸酶TALEN-B2和TALEN-B3组成，所述TALEN-B2特异剪切所述第一靶序列，所述TALEN-B3特异剪切第二靶序列。进ー步，所述靶序列为T(Nn)A结构的核苷酸序列，N为A，G，T和C中的任ー碱基，η为24至65之间的任一数字。进一步，所述目的基因为豕香油香基因。进ー步，所述第一靶序列如SEQ ID NO. 6所示核苷酸，所述第二靶序列如SEQ IDNO. 2所示核苷酸。进ー步，所述TALEN-B2由SEQ ID NO. 7所示和SEQ ID NO. 8所示核苷酸分别编码的蛋白质组成；所述TALEN-B3由SEQ ID NO. 3所示和SEQ ID NO. 4所示核苷酸分别编码的蛋白质组成。本专利技术目的之ニ在于提供基因组长片段删除系统的应用，技术方案为 所述基因组长片段删除系统在靶细胞中删除目的基因核酸序列的应用。进ー步，所述靶细胞为家蚕细胞。进一步，所述目的基因为豕香油香基因BtnBlos20本专利技术的有益效果在于本专利技术利用TALEN技术，通过在靶细胞内部同时使用2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN，2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN通过核定位信号NLS定位于细胞核中，然后识别蛋白特异识别靶序列，核酸酶FokI发生剪切，在基因内部同时存在2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN，能够删除识别靶序列之间的序列，与使用单个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN相比，基因序列发生变化更大，获得遗传变异大的品种。利用本专利技术提供的长片段删除体统遗传改造效率高，能够快速、准确在基因组中对目的基因实现遗传改造，为育种提供丰富的遗传资源。附图说明图I为本专利技术家蚕ガ 基因的结构示意图和转录激活子样效应因子核酸酶TALEN的剪切位点，其中数字表示外显子或内含子的长度，ATG和TAA分别表示起始和终止密码子，下划线表示转录激活子样效应因子核酸酶TALEN的识别位点。图2为本专利技术ガ 基因敲除以后家蚕的表型，其中WT表示野生型的家蚕个体，mutant表示突变体。 图3为本专利技术注射了 TALEN-B3后产生的突变序列，其中a图表示他孤od基因的部分结构示意图，上方的箭头表示PCR和测序引物的位置，b图表示来自与不同蛾圈的突变个体的序列，以“〉”开头的标识表示不同的蛾圈编号，是和“I”分别表示缺失、碱基替换和插入，其后的数字表示缺失、替换或插入的碱基数，“X”及后面的数字表示相应序列的条数，下划线的序列为TALEN的识别位点。图4本专利技术家蚕基因的结构示意图和长片段删除的結果。其中a图显示了豕査BmBlos2基因的结构不意图；b图显不了共注射后B2和B3后的PCR结果；图c表不共注射后B2和B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.基因组长片段删除系统，其特征在于所述基因组长片段删除系统由特异剪切目的基因内2个靶序列的2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN组成；所述2个靶序列为位于所述目的基因5’端的第一靶序列和位于所述目的基因3’的第二靶序列；所述2个转录激活子样效应因子核酸酶TALEN由转录激活子样效应因子核酸酶TALEN-B2和TALEN-B3组成，所述TALEN-B2特异剪切所述第一靶序列，所述TALEN-B3特异剪切第二靶序列。2.根据权利要求I所述的基因组长片段删除系统，其特征在于所述靶序列为T(Nn)A结构的核苷酸序列，N为A，G，T和C中的任一碱基，η为24至65之间的任一数字。3.根据权利要求I或2所述的基因组长片段删除系统，其特征在于所述目的基因为...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏庆友，马三垣，刘园园，徐汉福，林英，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：