脐带组织冻存、复苏以及分离和扩增干细胞的方法技术

本发明专利技术涉及脐带组织冻存、复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法，其包括如下步骤：配制脐带组织冻存液备用；对脐带组织进行消毒和清洗；将组织剪成块状；将组织块和冻存液加入冻存管中，在4℃的温度条件下低温冷藏0.5小时，再-80℃的温度条件下冷冻1天，然后液氮中冷冻备用;需要时将脐带组织从液氮中取出，恒温水浴解冻，利用间充质干细胞培养基进行点滴法清洗脐带组织，复苏的脐带组织可通过组织贴壁法分离和扩增间充质干细胞。本发明专利技术方法可有效保护冻存脐带组织，且方便复苏使用，尤其适合复苏后分离和扩增间充质干细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及处理脐带组织的方法，具体涉及脐带新鲜组织冻存、复苏以及复苏后干细胞分离和扩增的方法，特别涉及从脐带新鲜组织中分离和扩增间充质干细胞的方法。
技术介绍
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)来源于发育早期的中胚层和外胚层，具有多向分化潜能、免疫调节和自我复制等特点，日益受到人们的关注。间充质干细胞在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、心肌、内皮等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。 MSC在骨髄中蕴含丰富，但随着年龄的老化，骨髄中的干细胞数目也会显著降低、増殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髄MSC移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了骨髄MSC的临床应用，使得寻找骨髄以外其他可替代的间充质干细胞来源成为ー个重要的问题。近期的研究显示，脐带组织中也含有间充质干细胞并且能成功分离。这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且分离出来的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大减低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因足以令脐带间充质干细胞成为骨髓间充质干细胞的理想替代物。但是，脐带组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，而且每ー份脐带组织的处理和分离后的细胞培养都需要一定的时间和人员的消耗。因此将脐带组织冻存并且在有需要的时候复苏进行干细胞分离的做法相对更符合成本效益。因此，本领域需要ー个简单和高效的脐带组织冻存、复苏和间充质干细胞的分离和扩增的方法，以满足医药、科研、临床等领域的需求。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决现有技术冻存、复苏脐带组织方法的缺陷，提供一种简单有效的脐带组织冻存的方法，以及相配套使用的冻存脐带组织复苏的方法，以及复苏后间充质干细胞分离和扩增的方法。本专利技术发现使用特定操作步骤的冻存、复苏以及分离和扩増，可以有效地获得间充质干细胞。本专利技术基于此发现而得以完成。因此，本专利技术第一方面提供了处理脐带组织的方法，该方法包括以下对脐带离体新鮮组织进行冻存的步骤(I)配制脐带组织冻存液所述脐带组织冻存液中包含人血白蛋白和DMSO(ニ甲基亚砜)，配好的冷存液放在1°C至7V (例如4°C )的温度条件下低温冷藏；(2)消毒和清洗用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞；(3)脐带组织处理将步骤(2)得到的脐带组织剪成组织块；(4)脐带组织冷存在0-15°C (例如TC至TC，例如4°C )的低温环境下，将组织块和冻存液加入冻存容器中，然后将冻存容器放入程序降温装置，先在TC至TC (例如4°c )的温度条件下低温冷藏O. 2-2小时(例如O. 5小时)，再在-10°c至-150°C (例如_80°C )的温度条件下冷冻O. 25-3天(例如I天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用。根据本专利技术第一方面的方法，该方法还包括以下对冻存的脐带离体新鮮组织进行复苏的步骤(5)冻存脐带组织复苏将步骤⑷冷冻的脐带组织从液氮中取出，解冻至20%-70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗脐带组织，过滤去除废液，以使冻存的脐带组织复苏。 根据本专利技术第一方面的方法，该方法还包括以下对复苏的脐带组织进行间充质干细胞分离和扩增的步骤(6)脐带组织贴壁处理另取细胞培养平皿，将组织块平铺于平皿中，每个平皿中的组织块数量維持在5-20块(例如10-15块)，使组织块风干2-50分钟直至组织贴在平皿上；(7)脐带组织培养沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞培养基至组织淹没即可；将平皿放进CO2浓度为5%的37°C培养箱进行培养，培养至第3-7天(例如第4-6天，例如第5天)时将平皿从培养箱取出，补加适量(使组织淹没即可)间充质干细胞培养基；在第9-11天(例如第10天)时将平皿中的培养基移出，加入适量(使组织淹没即可)新鲜的间充质干细胞培养基，继续培养；在第11-13天(例如第12天)时清除所有脐带组织块并继续培养；此后每1-3天(例如每2天)进行一次全换液；(8)细胞传代当平皿内的贴壁细胞融合率达到50-70%左右吋，使用消化酶(例如TrypLE Express, invitrogen产品)使贴壁细胞脱离平皿底部；离心,去除上清液,加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于T25细胞培养瓶进行传代并进行扩增培养；此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%后，即得脐带间充质干细胞，必要时进行传代；以及任选的下列一个或多个步骤(9)针对步骤(8)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少ー项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；(10)将步骤⑶所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冻存，备用。根据本专利技术第一方面的方法，该方法包括(A)以下对脐带离体新鮮组织进行冻存的步骤(I)配制脐带组织冻存液所述脐带组织冻存液中包含人血白蛋白和DMSO(ニ甲基亚砜)，配好的冷存液放在1°C至7V (例如4°C )的温度条件下低温冷藏；(2)消毒和清洗用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞；(3)脐带组织处理将步骤(2)得到的脐带组织剪成组织块；(4)脐带组织冷存在0_15°C (例如TC至TC，例如4°C )的低温环境下，将组织块和冻存液加入冻存容器中，然后将冻存容器放入程序降温装置，先在TC至TC (例如4°c )的温度条件下低温冷藏O. 2-2小时(例如O. 5小时)，再在-10°c至-150°C (例如-80°C)的温度条件下冷冻O. 25-3天(例如I天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用；(B)以下对冻存的脐带离体新鮮组织进行复苏的步骤(5)冻存脐带组织复苏将步骤⑷冷冻的脐带组织从液氮中取出，解冻至20%-70%(例如50%)冻存液开 始融化，利用间充质干细胞培养基清洗脐带组织，过滤去除废液，以使冻存的脐带组织复苏；(C)以下对复苏的脐带组织进行间充质干细胞分离和扩增的步骤(6)脐带组织贴壁处理另取细胞培养平皿，将组织块平铺于平皿中，每个平皿中的组织块数量維持在5-20块(例如10-15块)，使组织块风干2-50分钟直至组织贴在平皿上；(7)脐带组织培养沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞培养基至组织淹没即可；将平皿放进CO2浓度为5%的37°C培养箱进行培养，培养至第3-7天(例如第4-6天，例如第5天)时将平皿从培养箱取出，补加适量(使组织淹没即可)间充质干细胞培养基；在第9-11天(例如第10天)时将平皿中的培养基移出，加入适量(使组织淹没即可)新鲜的间充质干细胞培养基，继续培养；在第11-13天(例如第12天)时清除所有脐带组织块并继续培养；此后每1-3天(例如每2天)进行一次全换液；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.处理脐带组织的方法，该方法包括 (A)以下对脐带离体新鮮组织进行冻存的步骤 (1)配制脐带组织冻存液所述脐带组织冻存液中包含人血白蛋白和DMSO(ニ甲基亚砜)，配好的冷存液放在1°C至7 V (例如4°C )的温度条件下低温冷藏； (2)消毒和清洗用消毒液(例如酒精)对脐带组织表面进行消毒，将脐带剪开，平铺，通过缓冲液(例如PBS缓冲液)清洗脐带组织，以减少脐带组织上红细胞； (3)脐带组织处理将步骤(2)得到的脐带组织剪成组织块； (4)脐带组织冷存在0-15°C(例如1°C至7°C，例如4°C )的低温环境下，将组织块和冻存液加入冻存容器中，然后将冻存容器放入程序降温装置，先在1°C至TC (例如4°C)的温度条件下低温冷藏0. 2-2小时(例如0. 5小时)，再在-IO0CM -150。。(例如-800C )的温度条件下冷冻0. 25-3天(例如I天)，然后将冻存容器于液氮中冷冻，备用； (B)以下对冻存的脐带离体新鮮组织进行复苏的步骤 (5)冻存脐带组织复苏将步骤⑷冷冻的脐带组织从液氮中取出，解冻至20%-70%(例如50%)冻存液开始融化，利用间充质干细胞培养基清洗脐带组织，过滤去除废液，以使冻存的脐带组织复苏； (C)以下对复苏的脐带组织进行间充质干细胞分离和扩增的步骤 (6)脐带组织贴壁处理另取细胞培养平皿，将组织块平铺于平皿中，每个平皿中的组织块数量維持在5-20块(例如10-15块)，使组织块风干2-50分钟直至组织贴在平皿上； (7)脐带组织培养沿平皿边缘慢慢加入间充质干细胞培养基至组织淹没即可；将平皿放进CO2浓度为5%的37°C培养箱进行培养，培养至第3-7天(例如第4-6天，例如第5天)时将平皿从培养箱取出，补加适量(使组织淹没即可)间充质干细胞培养基；在第9-11天(例如第10天)时将平皿中的培养基移出，加入适量(使组织淹没即可)新鮮的间充质干细胞培养基，继续培养；在第11-13天(例如第12天)时清除所有脐带组织块并继续培养；此后每1-3天(例如每2天)进行一次全换液； (8)细胞传代当平皿内的贴壁细胞融合率达到50-70%左右吋，使用消化酶(例如TrypLE Express, invitrogen产品)使贴壁细胞脱离平皿底部；离心,去除上清液,加入间充质干细胞培养基重新悬浮细胞，再接种于T25细胞培养瓶进行传代并进行扩增培养；此后每1-3天(例如每2天)换液一次，直至融合率达到70-90%后，即得脐带间充质干细胞，必要时进行传代； 以及任选的 (D)下列一个或多个步骤 (9)针对步骤(8)所得脐带间充质干细胞，检测以下项目的至少ー项细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型； (10)将步骤(8)所得传代后的脐带间充质干细胞于液氮中冻存，备用。2.根据权利要求I的方法，其中所述脐带组织冻存液中包含80重量份的人血白蛋白和10重量份的DMSO。3.根据权利要求I的方法，其中步骤(3)中，剪碎的组织是大小约0.2-2. 5立方厘米。4.根据权利要求I的方法，其中步骤(5)中，利用间充质干细胞培养基清洗脐带组织采用的是点滴法。5.根据权利要求I的方法，其中所述间充质干细胞培养基中包含FBS、L-Glutamine,Gentamicin 和 DMEM-F12。6.根据权利要求I的方法，其中 所述间充质干细胞培养基中含有10-20%的FBS ； 所述间充质干细胞培养基中含有0. 5-2%的L-Glutamine...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱业峰，林卓衡，陈俊峯，周丹，
申请(专利权)人：博雅干细胞科技有限公司，
类型：发明
国别省市：