一种水葫芦生防真菌拟盘多毛孢(Pestalotiopsiscrassipes)WH010菌株(菌株的保藏号为CGMCCNO.4418)，从水葫芦自然发病植株叶片中分离获得，该菌在常规培养条件很容易产孢，最适培养基为马铃薯蔗糖琼脂(PDA)，最适温度28℃，最适pH6.5；病菌侵染致病的最佳条件是接种浓度在>105个/mL，接种后保湿24h并保持温度25-28℃。其菌体制剂和毒素液对恶性杂草水葫芦具有很强致病杀草作用，经发酵菌体或毒素仿生合成技术可生产环保型真菌除草剂，具有潜在的商业开发应用价值。用真菌培养液经乙酸乙酯萃取和旋转蒸发器真空蒸发可得到致病粗毒素。该菌株的水剂和粉剂在田间自然条件对水葫芦的控制作用可达到76%以上。该菌菌体悬浮液及其毒素液对水稻等21种重要作物安全，无不良影响。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于杂草生物防治技术 领域，特别是涉及一种水葫芦生防真菌拟盘多毛孢iPestalotiopsis crassipes)菌株。
技术介绍
水葫芦又称凤眼莲,是世界十大害草之一，也是我国重要的外来入侵植物之一。广泛分布于亚洲、北美、大洋州和非洲的很多国家和地区。水葫芦于20世纪30年代传入我国，目前广泛分布在华南、华中和华东等地区，尤其以云南、四川、湖南、湖北、江西、江苏、浙江、福建和台湾等省市。该草适应性极强、生长速度很快、蔓延速度惊人，过度繁殖后难以有效控制，带来严重的水环境生态破坏和生物污染。目前水葫芦主要通过人工机械打捞、化学除草和生物防除控制。但人工打捞只能在短时间、小范围内起作用，而且费时费力。机械搅灭，受地域限制，成本高，不适合推广，而且打捞的水葫芦若不及时处理，蚊虫滋生，也会严重影响环境和人畜健康。化学除草剂不仅费用高，而且可能直接造成环境污染。因此近年来“应用植物病菌控制水葫芦”的生物防治研究受到人们的高度关注，国外已经报道了 70多种水葫芦致病真菌，其中有7种强致病菌株具有开发成水葫芦真菌除草剂的生防应用潜力。罗得曼尼尾孢{Cercosporarodmanii)防除水葫芦在国外已获专利保护。在我国已报道十余种水葫芦致病真菌，其中水葫芦一种假链格孢{Nimbya alternantherae SF193菌株)已获我国专利保护(专利号200710019832)，迄今还没有关于其它几种病菌的进一步研究和应用的详细报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种对水葫芦有很强致病作用和控制效果的杀草真菌。根据形态学特征和分子生物学手段将其鉴定为拟盘多毛孢菌{Pestalotiopsis photiniae)，'鱼过试验测定确定了它生长、产孢和侵染致病的最适条件，研究发现其通过产生毒素使杂草植株发病死亡的致病机理，分析了病菌及其毒素的寄主专化性。水葫芦强致病菌株分离纯化在重庆地区不同季节多次采集水葫芦自然发病植株，采用马铃薯蔗糖琼脂培养基(PDA)，经室内组织培养和纯化得到多种真菌，用柯赫氏证病方法确定其中的致病菌，最后经过致病性试验比较筛选，获得了这种对水葫芦有很强致病作用的杀草病原真菌(WH010)。本专利技术的水葫芦拟盘多毛孢菌株(WH010)已于2010年12月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号=CGMCC NO. 4418。菌株的形态特征(图I)鉴定在PDA培养基上25 °C培养5 d菌落(图1A)直径可达64 mm以上，光照与黑暗对病菌生长产孢没有明显的影响。病菌菌落圆形，表面气生菌丝较发达，白色，短絮状，呈辐射状扩展；菌丝(图1C)无色，分隔，直径约I. 3-2. 7 μπι。14-15 d后菌落表面长出黑色油圆球状或不规则状、具光泽而湿润的分生孢子堆，呈放射状分布；随培养时间延长，分子孢子堆大量产生，有的在菌落表面联合成片。分生孢子(图1D)纺锤形或倒棍棒状，大小为14. 2-28. 5X4. 1-7. 8 μ m,直或稍微弯曲，5个细胞，各细胞之间分隔均为真隔膜，两端细胞壁薄，无色，中间3个细胞呈橄榄褐色，色泽一致；顶部细胞无色，圆锥形，比次顶部细胞直径明显变小，顶端附属丝2-3条，基部细胞无色倒圆锥形，中生式尾毛I根，约为附属丝长度的1/4。分生孢子梗较短，着生于分生孢子盘基部，无色或浅褐色，分隔，不规则分枝。对病组织进行切片可见分生孢子盘杯状，散生或集生，初埋生后外露，黑色或暗褐色底层由厚壁、角状 、暗褐色细胞构成，盘表面产孢区细胞壁薄，色淡。根据病菌的这些形态学特征鉴定，其无性阶段属于拟盘多毛孢属真菌iPestalotiopsis sp.),实验中未发现其有性阶段。菌株分子技术鉴定提取菌株的基因组DNA，采用rDNA ITS通用引物和 β-tubulin 引物ITS5 (5 ' -GGAAGTAAA AGT CGTAACAAGG-3 ')、ITS4(5 ' -TCCTCCGCTTATTGATA TGC-3 ' )、Bt2a(5 ' -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3 ')、Bt2b(5/ -ACCCTCAGTGTAGTGACC CTTGGC -3/ )进行 rDNA ITS 和 β-tubulin 序列的 PCR扩增，获得长度为550bp( rDNA ITS)和453 bp ( β-tubulin)基因片段(详见序列表)，在Genbank的登录号分别为JF502635和JQ694097。将所得序列登陆到www. ncbi. nlm. nih.gov网站，进行BLAST比对，由比对结果可知，WH010的rDNA ITS、β -tubulin区段的序列与Pestalotiopsis photiniae的序列具有99%的相似性,从而确定WH010与石楠拟盘多毛抱{Pestalotiopsis photiniae)是同一个种。菌株的最佳培养和接种侵染条件该真菌菌落生长和产生分生孢子的最适培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)，最适温度28 °C，最适酸碱度为pH6. 5，在这些条件下，菌落生长快，大量产生大分生孢子；光照对真菌生长产孢无明显影响。病菌侵染致病的最佳条件是接种浓度在IO5个/mL数量级或更高，接种后保湿和暗光24小时，并在整个侵染期保持温度 25-28 0C0菌株的致病性和专化性水葫芦拟盘多毛孢对水葫芦良好的致病作用和生长抑制效果。主要侵染植株叶片。在室内用病菌的分生孢子悬浮液直接喷雾接种后，4 d即可发病，植株叶片出现典型发病病斑；12 d病植株率达100%,植株叶片开始失水黄化；18 d以后整个植株萎蔫死亡，其对水葫芦的控制效果与敌克踪、草甘膦相当。在田间接种后效果显现稍延迟，第8 d植株顶部全部黄化，18 d后萎蔫死亡。在适宜条件下用高浓度分生孢子悬浮液(IO5个/mL)接种试验结果表明，该真菌对水稻、小麦、玉米、豌豆、油菜、辣椒、番茄、棉花等重要作物在内的7科21种水、旱作物都不致病，也不影响它们的种子萌发和植株生长，这说明水葫芦拟盘多毛孢是水葫芦的专性致病菌，若用于研制水葫芦除草剂，可以保证生境中其它植物的安全。菌株的粗毒素用马铃薯葡萄糖(以下简称PD)培养液培养7 d后，四层纱布过滤I次，所得滤液再用双层层析滤纸过滤，然后滤液离心20 min，转速为4000 r/min，所得上清液经过乙酸乙酯萃取、旋转蒸发器真空蒸发得到致病粗毒素。用该毒素的水液分别浸溃水葫芦叶片后2 d内即表现毒性症状，5 d内叶片黄化。用此粗毒素溶液处理前述20种植物的种子和植株后未观察到毒性症状，说明这种毒素也是高度专化的。7. WH010菌株生防制剂的制备和应用将保藏菌种移殖于试管PDA斜面培养基中进行活化，将活化后的拟盘多毛孢WH010移入PDA平板培养基上培养5 d后，取菌饼接种到PD液体培养基中，振荡培养后过滤获得孢子和培养滤液的混合液体,可将所得滤液直接加工成悬浮剂，或将菌种接种在灭菌麦麸上，固体发酵后收取孢子加工成粉剂。将所得的生防制剂稀释后均匀地喷雾在水葫芦叶面，每平方米喷雾用量为稀释后的菌液50 mL。喷雾处理3 d后水葫芦开始发病，15 d后部分植株枯萎死亡(图5) ;1个月后测定，水葫芦的生长抑制率可达到76. 3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种水葫芦生防真菌拟盘多毛孢{Pestalotiopsis crass ipes),从水葫芦{Eichhornia crassipes)自然发病植株叶片上分...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡丽，谭万忠，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：
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