一株产甘草次酸的甘草内生真菌，它涉及一株内生真菌。产甘草次酸的甘草内生真菌，它为尖孢镰刀菌(Fusarium?oxysporum)RE5，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC?No：M?2012046，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本发明专利技术中尖孢镰刀菌(Fusarium?oxysporum)RE5，其代谢物具有较好的抑菌活性，同时从其代谢物中发现其含有甘草次酸，本发明专利技术对采用甘草内生真菌RE5生产甘草次酸具有指导意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株内生真菌。
技术介绍
甘草为豆科(Leguminosae)甘草属(Glycyrrhiza Linn)属乌拉尔甘草(G. uralensis Fisch)，胀果甘草(G. inflate Bat)和光果甘草(G. glabra L)的干燥根和根茎，广泛分布于我国东北、西北及华北等地。甘草性味甘平，为补气类中药，具有补中益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和药性等功效。中医处方离不开甘草，自古至今，广为药用，兼有“国老”的尊号。近年来，野生甘草因过度采挖强度而濒临灭绝，甘草已被列入《野生药材资源保护条例》的国家二级保护植物。、植物内生真菌是产生活性物质和新化学物质的潜在资源，不但可以帮助维护人类健康，也可以维护动物和植物的健康。实验研究表明，药用植物与内生真菌在相互作用的过程中，有的内生真菌能产生与植物相同或相似的活性物质，因此从药用植物中分离能够产生活性物质的内生真菌已成为当今学者的研究趋势。
技术实现思路
本专利技术提供了一株产甘草次酸的甘草内生真菌。本专利技术产甘草次酸的甘草内生真菌，它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No M 2012046，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日；它在PDA固体培养基上培养7d后，菌落直径为6 8cm，中心凸起，菌落为白色，后中央变为深红色，菌丝密集，毡状，基质深红棕色，产分生孢子，分生孢子头呈长圆筒形，分生孢子着生于单生瓶梗上，在瓶梗顶端聚成球团，分生孢子单生，单细胞，卵形。本专利技术甘草次酸的甘草内生真菌,它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5,其ITS序列提交至NCBI网页，应用BLAST分析进行同源性比较，采用MEGA 4. I软件中Alignment Explorer对菌株RE5与相关菌株进行同源性分析,构建系统发育树,在系统发育树中，菌株RE5与Fusarium oxysporum strain CPRI15在同一个分支上，其18S rDNA序列相似性为97%，与菌株RE5在同一簇上的其它菌都属于镰孢霉属，相似性都是97%，结合形态学观察结果，确定菌株RE5应归于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的一个新菌株。本专利技术产甘草次酸的甘草内生真菌,它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5,已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC No M 2012046，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本专利技术利用微生物制药手段提取分离野生甘草健康植株的内生真菌RE5同时以甘草次酸为对照，采用HPLC法分析检测RE5的发酵液，结果从甘草内生真菌RE5发酵液中检测到甘草的主要活性成分甘草次酸，说明内生真菌RE5能够产生与宿主药用植物甘草相同的活性成分——甘草次酸。将获得的RE5菌株通过形态学观察和18S rDNA序列分析鉴定其种属。本专利技术产甘草次酸的甘草内生真菌,它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5,其代谢物具有较好的抑菌活性，同时从其代谢物中发现其含有甘草次酸，本专利技术对采用甘草内生真菌RE5生产甘草次酸具有指导意义。附图说明图I为具体实施方式一中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5的菌落形态图；图2为具体实施方式一中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5的孢子显微结构 图；图3为具体实施方式一中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5的18S rDNA提取后进行扩增，PCR检测结果的电泳图，其中M泳道表示Marker，G泳道表示RE5 ；图4为具体实施方式一中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5的菌落PCR检测结果的电泳图，其中M泳道表示Marker，G泳道表示RE5 ；图5为具体实施方式一中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5的系统进化树；图6为具体实施方式一中甘草次酸对照品的HPLC色谱图，其中a表示甘草次酸；图7为具体实施方式一中供试品RE5的HPLC色谱图，其中a表示甘草次酸；图8为具体实施方式一中加入对照品后供试品RE5的HPLC色谱图，其中a表示甘草次酸；图9为具体实施方式一中空白对照品的HPLC色谱图。具体实施例方式具体实施方式一本实施方式产甘草次酸的甘草内生真菌，它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5,已在中国典型培养物保藏中心保藏,保藏编号为CCTCC No M2012046，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏日期为2012年2月29日。本实施方式中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5,它在PDA固体培养基上培养7d后，菌落直径为6 8cm，中心凸起，菌落为白色，后中央变为深红色，菌丝密集，毡状，基质深红棕色，产分生孢子，分生孢子头呈长圆筒形，分生孢子着生于单生瓶梗上，在瓶梗顶端聚成球团，分生孢子单生，单细胞，卵形。本实施方式中尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum) RE5,其生长温度为28°C,生长pH值自然。本实施方式中产甘草次酸的甘草内生真菌，它为尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum) RE5,该菌株分离自健康的野生甘草的根莖，采自大庆地区,植株年龄3年,植株健壮，无病虫害，其样本现存于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室；它按以下步骤进行分离培养选取健康的野生甘草的根茎用自来水冲洗干净后以无菌滤纸吸干水分，切成Icm小段，然后于无菌超净台内将甘草的根茎按下述方法进行表面消毒75%酒精浸泡lmin-2%次氯酸钠浸泡15min-无菌水冲洗3次；用无菌手术刀将野生甘草的根茎从中间切开，分别置于5%甘草提取液马铃薯固体分离培养基和5%甘草提取液马铃薯液体分离培养基中，于28°C恒温水浴摇床和恒温培养箱中，培养3 5d,待实验材料周围长出菌体，挑取菌体转入平板多次划线分离纯化，将纯化后的菌株置于斜面固体培养基中，4°C保存备用；其中5%甘草提取液马铃薯固体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖、20g的琼脂和余量的5%甘草提取液组成，pH值为7. 0 7. 2，121°C下高压灭菌30min ；5%甘草提取液马铃薯液体分离培养基每L由200g的马铃薯、20g的葡萄糖和余量的5%甘草提取液组成，pH值为7. 0 7. 2，121 °C下高压灭菌30min ；’斜面固体培养基为取5mL5%甘草提取液马铃薯固体分离培养基装于试管中，121°C高压灭菌30min后，铺成斜面冷却，以备保存菌种。结果从野生甘草的根茎中分离出内生真菌RE5，并且阴性对照中对照平板和对照液体培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。筛选出的内生真菌RE5根据《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》进行形态学鉴定，其菌株的形态学特征与镰孢霉属菌特征极为相近，菌落形态如图I所示，孢子显微结构如图2所示；分子鉴定内生真菌RE5发酵液抽滤得菌丝体用25 %乙醇漂洗2次，灭菌的去离子水冲洗2次，吸干残余液体，使沉淀尽可能干燥，然后在液氮本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1. 一株产甘草次酸的甘草内生真菌，其特征在于它为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)RE5，已在中国典型培养...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑春英，谭佳音，白长胜，孙雅北，孔德崴，
申请(专利权)人：黑龙江大学，
类型：发明
国别省市：
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