双重可变结构域免疫球蛋白及其用途制造技术

本发明专利技术涉及工程改造的多价和多特异性结合蛋白，制备方法，和具体而言涉及其在疾病预防、诊断和/或治疗中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及多价和多特异性结合蛋白、制备方法、和具体而言涉及其在诊断、预防和/或治疗急性和慢性炎性疾病、癌症及其他疾病中的用途。
技术介绍
工程改造的蛋白，例如能够结合2种或更多抗原的多特异性抗体是本领域已知的。此种多特异性结合蛋白可以使用细胞融合、化学缀合、或重组DNA技术来产生。基于2种不同杂交瘤细胞系的体细胞融合，已使用四源杂交瘤(quadroma)技术(參见 Milstein，C.和 A.C. Cuello (1983) Nature, 305 (5934):第 537-40 页)生产了双特异性抗体，所述杂交瘤细胞系表达具有双特异性抗体的所需特异性的鼠单克隆抗体(mAbs)。因为2种不同免疫球蛋白(Ig)重和轻链在所得到的杂种-杂交瘤(或四源杂交瘤)细胞系内随机配对，所以产生最高达10种不同Ig种类，其中只有一种是功能性双特异性抗体。错配对副产品的存在和显著減少的生产得率意味着需要复杂的纯化程序。双特异性抗体也可以通过2种不同mAbs的化学缀合来生产(參见，Staerz, U. D.,等人(1985)，Nature 314 (6012):第628-31页)。这种方法不产生均质制剂。其他方法已使用2种不同mAbs或较小抗体片段的化学缀合(參见Brennan, Μ.,等人(1985), Science229 (4708) 第 81-3 页)。用于产生双特异性抗体的另ー种方法是用异双功能交联剂偶联2种亲本抗体，但所得到的双特异性抗体经受显著的分子异质性，因为交联剂与亲本抗体的反应不是定点的。为了获得更均质的双特异性抗体制剂，2种不同Fab片段已以定点方式在其铰链半胱氨酸残基上进行化学交联(參见Glennie，M.J.，等人(1987)，J Immunol 139 (7):第2367-75页)。但这种方法产生Fab’ 2片段，而不是全IgG分子。已开发了广泛多样的其他重组双特异性抗体形式(參见Kriangkum, J.,等人(2001), Biomol Eng 18 (2):第31-40页)。在它们当中，串联单链Fv分子和双抗体(diabody)、及其各种衍生物是最广泛使用的。常规地，这些分子的构建从识别不同抗原的 2 个单链 Fv (scFv)片段开始(參见 Economides, A. N.,等人(2003), Nat Med 9 (I):第47-52页)。串联scFv分子(taFv)代表用另外的肽接头简单连接2个scFv分子的简单形式。这些串联scFv分子中存在的2个scFv片段形成分开的折叠实体。各种接头可以用于连接2个scFv片段和接头具有最高达63个残基的长度(參见Nakanishi，K.，等人(2001)，Annu Rev Immunol 19 :第423-74页)。尽管亲本scFv片段可以以可溶形式在细菌中正常 表达，然而，常常观察到串联scFv分子在细菌中形成不溶性聚集体。因此，重折叠规程或哺乳动物表达系统的使用常规应用于生产可溶性串联scFv分子。在近期研究中，报道了通过转基因兔和牛体内表达针对⑶28的串联scFv和黑素瘤相关蛋白聚糖(參见Gracie，J. A.，等人(1999)，J Clin Invest. 104 (10):第 1393-401 页)。在这个构建体中，2 个 scFv 分子通过CHl接头进行连接，且得到最高达100 mg/L的双特异性抗体血清浓度。使用各种策略包括结构域顺序变化或使用具有变化长度或柔性的中间接头，以允许在细菌中可溶性表达。少数研究现在已报道了使用非常短的Ala3接头或长的富甘氨酸/丝氨酸接头，在细菌中表达可溶性串联scFv分子(參见Leung，B. P.，等人(2000)，J Immunol 164 (12)第 6495-502 页；Ito, A.，等人(2003)，J Immunol 170 (9):第 4802-9 页；Kami, A.，等人(2002)，J Neuroimmunol 125 (1-2):第134-40页)。在另ー个近期研究中，包含长度为3或6个残基的随机化中间接头的串联scFv谱(repertoire)曬菌体展示,用于富集以可溶和活性形式在细菌中生产的那些分子。这种方法导致分离具有6个氨基酸残基接头的串联scFv 分子(參见 Arndt，M.和 J. Krauss (2003)，Methods Mol Biol 207 :第 305-21 页)。这种接头序列是否代表串联scFv分子可溶性表达的一般解决方案仍不清楚。然而，这项研究证明串联scFv分子的噬菌体展示与定向诱变组合是富集这些分子的有力工具，所述分 子可以以活性形式在细菌中表达。双特异性双抗体(Db)利用双抗体形式用于进行表达。通过使连接VH和VL结构域的接头长度减少至约5个残基，由scFv片段生产双抗体(參见Peipp,M.和T. Valerius(2002), Biochem Soc Trans 30 (4):第507-11页)。接头尺寸的这种减少通过使VH和VL结构域交叉配对促进2条多肽链的ニ聚化。双特异性双抗体通过在相同细胞内表达2条多肽链来生产，所述2条多肽链具有结构VHA-VLB和VHB-VLA (VH-VL构型)、或VLA-VHB和VLB-VHA(VL-VH构型)。在过去已生产了大量品种繁多的不同双特异性双抗体，并且它们中的大多数以可溶形式在细菌中表达。然而，近期的比较研究证明可变结构域的方向可以影口向活性结合位点的表达和形成(參见Mack,M.,等人(1995), Proc Natl Acad Sci U S A 92(15):第7021-5页)。然而，在细菌中的可溶性表达代表超过串联scFv分子的重要优点。然而，因为2条不同多肽链在单个细胞内表达，所以可以生产无活性同ニ聚体连同活性异ニ聚体。这使另外纯化步骤的执行成为必需，以获得双特异性双抗体的均质制剂。促使双特异性双抗体产生的ー种方法是结进孔(knob-into-hole)双抗体的生产(參见Holliger, P. , T.Prospero 和 G. Winter (1993), Proc Natl Acad Sci U S A 90 (14):第 6444-8. 18 页)。该方法对于针对HER2和⑶3的双特异性双抗体进行了证明。通过用Phe交换Val37和用Trp交换Leu45将大结引入VH结构域内，且在抗HER2或抗⑶3可变结构域中，通过使Phe98突变为Met和使Tyr87突变为Ala在VL结构域中产生互补孔。通过使用这种方法，双特异性双抗体的生产可以从经由亲本双抗体的72%增至经由结进孔双抗体的超过90%。重要的是，作为这些突变的结果生产得率只有轻微減少。然而，对于几种构建体观察到抗原结合活性的減少。因此，这种相当精细的方法需要分析各种构建体，以鉴定产生具有不变结合活性的异ニ聚分子的那些突变。此外，此种方法需要免疫球蛋白序列在恒定区的突变修饰，因此生成非天然和非自然形式的抗体序列，这可以导致免疫原性増加、体内稳定性差、以及不希望有的药物代谢动力学。单链双抗体(scDb)代表改善双特异性双抗体样分子形成的可替代策略(參见Holliger, P.和 G. Winter 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：T哈于尔，RV卡马思，J刘，MP霍诺尔，
申请(专利权)人：雅培制药有限公司，
类型：发明
国别省市：