一种尿样中肌氨酸的定量检测方法技术

本发明专利技术涉及一种尿样中肌氨酸的定量检测方法，属化学定量分析领域，其步骤依次为：（1）用有机溶剂乙腈对尿样进行稀释处理，加入内标工作液肌氨酸-d3，混旋离心，弃沉淀，吸取上清液与乙腈混合，供分析测试；（2）以硅胶键合相填料为分析柱，流动相乙腈水溶液中加入甲酸和甲酸铵作为改性剂，使肌氨酸与其他干扰物质色谱分离；（3）采用电喷雾离子化串联质谱仪，在正离子检测模式下，检测肌氨酸；（4）结果计算：以获得的峰面积或峰高度，按同位素稀释内标法计算肌氨酸在尿样中的含量。本发明专利技术方法的特异性、灵敏度和准确性高，且成本低廉、简单快速，适用于临床上低成本、大批量尿样中肌氨酸定量检测的要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属化学定量分析
，具体涉及一种肌氨酸的定量检测方法，尤其涉及。
技术介绍
目前前列腺癌的筛查诊断方法主要包括血清前列腺特异抗原测定(PSA)、直肠指检、经直肠超声检查、前列腺组织穿刺活检等。PSA筛查被认为是预测前列腺癌最好的指标，并在临床上广泛应用。但其特异性有限，有些前列腺增生和前列腺炎患者PSA也会升高，误诊情况时有发生。前列腺系统性穿刺活检是诊断前列腺癌最可靠的方法，属于侵入性检查，需要在B超引导下进行，检查结果严重依赖于穿刺位置的准确性。更为重要的 是，已有的诊断方法往往使临床肿瘤医生能轻易地诊断出前列腺癌，却无法判断癌细胞的生物学特性是侵袭性还是非侵袭性，即判断癌症的危险性。而这有可能导致恶性前列腺癌患者丧失了最佳的治疗机会。通过检测生物样本中小分子或者大分子生物标志物是疾病筛查与诊断的有效手段，对于疾病的早期诊断、治疗和预后具有重要的参考价值和临床意义。因此无论从解决临床前列腺癌诊治难题的角度出发，还是从提高癌症患者的生存率并降低治疗成本的角度出发，寻找特异性更高的生物标志物，特别是能表征前列腺癌侵袭性的生物标志物，都是临床上亟需解决的问题。肌氨酸是一种存在于人体肌肉和其他组织的天然氨基酸，为甘氨酸的代谢产物。研究表明，肌氨酸在侵袭性前列腺癌中含量显著升高，且可在尿样中检测出来，66例前列腺癌患者和200例正常健康人尿肌氨酸水平分别为404 ng/mL和104 ng/mL，肌氨酸值在前列腺癌病例中明显增加(/7〈0. 001)。尿样中肌氨酸及肌氨酸/肌酐比值的受试者工作特征曲线(R0C曲线)下面积分别为0.904和0.946。提示肌氨酸具有非常高的检验灵敏度和特异性。这使得肌氨酸成为前列腺癌非损伤性诊断的一个候选生物标志物，也有可能成为新的更好的前列腺癌诊断标志物。目前对于肌氨酸的检测，分别采用高效液相色谱法、气相色谱一质谱法和液相色谱一质谱法，主要缺陷是特异性差，难以实现肌氨酸与干扰物质的完全分离，样品的处理方法步骤比较复杂。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供，能准确灵敏地定量检测尿样中肌氨酸的含量。为达到上述目的，本专利技术提供的，其特征在于 (I)尿样乙腈稀释随机取100 i! L尿样，加入20 UL浓度为50 U g/mL肌氨酸-d3内标工作液，加入200 V- L乙腈,混旋30s, 15000 rpm离心3 min,弃沉淀,吸取100 u L上清液与300 u L乙腈混合，转移至进样瓶，供分析测试；(2)色谱分离以硅胶键合相填料为分析柱，以水溶液为流动相A，乙腈溶液为流动相B，所述A相中含有0.02 0.4%甲酸和I 5mmol/L甲酸铵作为改性剂，流速为0. I I mL/min，等度洗脱或者梯度洗脱，将肌氨酸从分析柱上洗脱，与其他干扰物质实现色谱分离； (3)质谱检测采用电喷雾离子源串联质谱仪，在正离子检测模式下，多反应监测扫描分析，检测肌氨酸； (4)结果计算以质谱检测获得的肌氨酸峰面积或峰高度，按同位素稀释内标法计算肌氨酸在尿样中的含量。所述步骤(3)质谱检测离子源参数设置为肌氨酸检测通道m/z 90/44,肌氨酸_d3检测通道m/z 93/47，离子通道范围为±0.5 m/z。 本专利技术定量检测尿样中肌氨酸的含量，属于非损伤性检测方法。采用乙腈稀释处理尿样，以硅胶键合相填料柱为分析柱，流动相添加甲酸和甲酸铵为改性剂，等度洗脱或者梯度洗脱，在正离子模式下，以多反应监测法测定，以肌氨酸质谱检测获得的峰面积或峰高度，按同位素稀释内标法定量检测。本专利技术能实现肌氨酸和内源性干扰物完全分离而不相互干扰，肌氨酸的最低定量限可达100 ng/mL,方法的精密度(以相对标准偏差计)小于12%，准确度为87. 8%-99. 5%。方法的特异性、灵敏度、精密度和准确性较高，且成本低廉、简单快速，适用于临床上低成本、大批量尿样中肌氨酸定量检测的要求。附图说明图I肌氨酸的标准曲线； 以肌氨酸浓度为X轴，以肌氨酸与内标峰面积比值为Y轴，经过1/X权重处理，在浓度100 ng/mL至5000 ng/mL范围内，线性相关系数为0.9998。图2尿样中肌氨酸的色谱图。图中I 一肌氨酸色谱峰，2 —干扰物色谱峰。由图示可见，本专利技术能实现肌氨酸I和干扰物2的完全分离而不相互干扰，具有良好的色谱分辨能力。具体实施例方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步阐述，旨在说明本专利技术涉及的技术方案，揭示本专利技术的最佳实施例，使本领域技术人员能够理解和实施本专利技术。但应当理解本专利技术并不限于公示的实施例，基于本专利技术的启示，任何显而易见的变换或替代，也应当被认为是落入本专利技术的保护范围。标准曲线和质控配制用20%乙腈的水溶液配制，肌氨酸标准曲线浓度为100、200、500、1000、2000、5000 ng/mL。用20%乙腈的水溶液配制肌氨酸最低定量浓度(100 ng/mL)，低浓度(300 ng/mL)，中浓度(1200 ng/mL)，高浓度(4000 ng/mL)的质控样品。另随机取6份尿样，作为方法检测的实际尿液样品。实施例中各物料的浓度除特别注明的以外，均为体积百分浓度。实施例I 检测尿样中肌氨酸浓度。(I)尿样乙腈稀释随机取100 ii L尿样，加入20 UL浓度为50 U g/mL肌氨酸_d3内标工作液，加入200 ii L乙腈,混旋30s, 15000 rpm离心3 min,弃沉淀,吸取100 y L上清液与300 u L乙腈混合，转移至进样瓶，供分析测试。(2)色谱分离以娃胶键合相填料柱(2. I X 100mm, 5 ii m, Hypersil, Thermo)为分析柱；流动相A为含0.02%甲酸和lmmol/L甲酸铵的水溶液，流动相B为乙腈，流动相A 流动相B的体积比为60% 40%,流速为0. 3mL/min,等度洗脱，进样量5 u L，将肌氨酸从分析柱上洗脱。(3)质谱检测采用电喷雾离子源串联质谱仪(API 4000，美国AB Sciex公司)，在正离子检测模式下，多反应监测扫描分析，肌氨酸检测通道90/44 (±0.5 m/z)，肌氨酸-d3检测通道93/47 (±0.5 m/z)。离子源参数设置为离子化电压5000V ;离子化温度550°C ;喷雾气60 psi ;加热气60 psi ;气帘气25 psi ;碰撞气中等；去簇电压21V ;入口电压4 V ;碰撞能20 V ;出口电压 6 V。(4)结果计算方法为，以质谱检测获得的肌氨酸峰面积，与标准曲线比较，按内标法计算尿样中肌氨酸的含量。建立肌氨酸的标准曲线，以肌氨酸浓度为X轴，以肌氨酸与内标峰面积比值为Y轴，经过1/X权重处理，在浓度100 ng/mL至5000 ng/mL范围内，线性相关系数为0.9998 (图I)。说明本专利技术提供的尿样中肌氨酸的检测方法线性关系良好。质控样品中肌氨酸的检测精密度(以相对标准偏差计)为3. 68% 10. 5%，准确度为92. 6% 103. 5%，说明本专利技术具有精密准确的定量能力。随机取6份尿样，编号为1、2、3、4、5、6，经过标准曲线计算，尿肌氨酸浓度分别为136>147>150>215>246>107 ng/mL,说明本专利技术能实现尿本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李水军，余琛，周菊珍，郦俊生，朱建民，贾晶莹，刘罡一，张梦琪，茅晓寅，
申请(专利权)人：上海市徐汇区中心医院，
类型：发明
国别省市：