本发明专利技术公开了一种副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体及抗原捕获ELISA试剂盒。该副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCC?No.6061的杂交瘤细胞株分泌产生。该副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体可用于检测副溶血性弧菌。本发明专利技术还公开了一种副溶血性弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫学领域，具体涉及ー种副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，杂交瘤细胞株及抗原捕获ELISA试剂盒。
技术介绍
副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus,VP)是一种嗜盐性细菌。副溶血性弧菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，主要来自海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存I个月以上，海水中可存活47天。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。近年来由于海鲜空运，内地城市病例也逐渐增多。目前检测食品中致病微生物的方法主要以传统方法为主，即分离鉴定方法，该方法所需时间长，一般情况下需要5-7天，有时达到10-15天，很难满足快速鉴定的需要；近几年发展起来的PCR技木，是ー种快速、灵敏、特异性好的技术，但是目前该技术还是依赖于传统方法的前增菌步骤，增菌液中往往含有PCR抑制剂，从而影响PCR的扩增结果；以抗体为基础的免疫学检测已经成为食品中有毒有害物质及有害生物检测不可或缺的重要技术手段。目前已经发展了多种特异性免疫学检测技术，如放射免疫分析(RIA)、酶免疫分析(EIA)、荧光免疫分析(FIA)、时间分辨荧光免疫分析(TrFIA)、化学发光免疫分析(CIA)、生物发光免疫分析(BIA)、免疫沉淀反应、免疫凝集反应、ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条、免疫乳胶检测试剂等。其中ELISA检测试剂盒、免疫胶体金试纸条等多种以抗体为基础的免疫学检测技木，以其简便、快速、灵敏、准确、实用的特点一直是国境检验检疫安全侦检技术体系中的重要组成，已经成为有害生物及有毒有害物质检测不可或缺的重要技术手段。快速的ELISA方法检测，作为筛选方法具有快速、灵敏的特点，是受到广泛欢迎的筛选方法，但是所使用的试剂盒均来自国外，价格昂贵，而且需要配备其专门的仪器。因而，研究开发具有自主知识产权的食源性致病微生物的抗体,是开发拥有自主知识产权的ELISA检测方法、胶体金检测方法、基于免疫反应为基础的免疫纳米磁珠富集方法的基础。鞭毛是副溶血性弧菌的ー个重要毒力因子，具有特异性的鞭毛抗原(H抗原)，常作为血清学鉴定的依据之一。细菌的鞭毛具有很重要的理化特性，它的免疫原性在生物学和致病机制研究中具有重要的意义。例如，鞭毛蛋白被认为是一种保护性的抗原用于致病菌的疫苗研究，有研究结果表明，鞭毛蛋白可作为天然免疫应答的诱导剂，诱导产生的天然免疫应答可帮助建立针对外源抗原的获得性免疫应答，从而显示出鞭毛蛋白作为免疫佐剂的特性。在已往的副溶血性弧菌单克隆抗体的制备过程中，多使用灭活的VP菌体作为抗原，而菌体的大部分蛋白为菌属共有蛋白，不具有种间特异性，导致收获的单抗很难避免弧菌菌属内的种间交叉反应。本研究选用具有种间特异性的鞭毛蛋白作为抗原，并且在阳性克隆筛选过程中排除交叉反应，制备特异性良好的VP单克隆抗体，并将其应用于制备副溶血性弧菌ELISA检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术所要解决的第一个技术问题是提供ー种副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体。该单克隆抗体可以用于检测副溶血性弧菌。本专利技术所要解决的第二个技术问题是提供ー种副溶血性弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒。 为解决上述技术问题，本专利技术所提供的技术方案如下本专利技术所提供的副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体，是由保藏编号为CGMCCNo. 6061的小鼠杂交瘤细胞株分泌产生。该小鼠杂交瘤细胞株已于2012年4月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址是中国北京市朝阳区北辰西路I号院3号)，保藏编号为其保藏编号为CGMCC No. 6061。保藏编号为CGMCC No. 6061的小鼠杂交瘤细胞株也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了ー种副溶血性弧菌鞭毛蛋白捕获ELISA试剂盒，该试剂盒包括已包被副溶血性弧菌鞭毛蛋白多克隆抗体的固相载体和酶标记的本专利技术所述的单克隆抗体。所述酶优选为辣根过氧化酶。进一歩地，为了便于检测，本专利技术试剂盒还包括阳性对照和阴性对照，以及ELISA反应所需的酶联免疫检测试剂。其中，所述阳性对照为副溶血性弧菌鞭毛蛋白，所述阴性对照为未免疫副溶血性弧菌鞭毛蛋白的正常小鼠血清或其稀释液。所述酶联免疫检测试剂，均为常规的酶联免疫检测试剂，包括但不限于，酶的底物反应液、洗涤液和反应终止液。本专利技术具有以下优点和效果首先，本专利技术通过特异性实验，包括30株副溶血性弧菌和28株非副溶血性弧菌标准菌株，显示出良好的特异性和稳定性。其次，敏感性实验结果表明本专利技术试剂盒的检测敏感性为IO3/孔，明显高于微生物传统检测方法，并且具有快速、高效等优点。附图说明图I.副溶血性弧菌鞭毛蛋白的SDS-PAGE图；泳道I :副溶血性弧菌鞭毛蛋白；泳道2 :蛋白Marker ；图2.副溶血性弧菌ATCC17802菌体和鞭毛电镜；图3.副溶血性弧菌ATCC17802鞭毛蛋白电镜；图4. mAb 的 SDS-PAGE 图；泳道 I :蛋白 Marker ;泳道 2 :mAb。具体实施例方式下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例I副溶血性弧菌鞭毛蛋白单克隆抗体的制备I.菌体培养及鞭毛蛋白的提取副溶血性弧菌(VibrioparahemolyticusXATCC 17802,实验室保存)接种于 TlNl培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司，货号CM168)，36°C活化24h;挑取单菌落接种于含2%NaCl的TSA培养基(购自北京陆桥技术有限责任公司，货号CM417)生长18 24h ;用无菌棉签将生长良好的菌落均匀涂布在TSA (2%NaCl)培养基上，36°C培养18±2h。次日用无菌棉签刮下菌体悬浮于预冷的O. 15M NaCl溶液中，冰浴15 30min，IOOOrpm匀浆45sec，立即置于冰上lOmin。匀浆液4°C条件下IOOOOrpm离心IOmin ;取上清液4°C条件下16000rpm离心 2h，弃上清，沉淀重悬于 TET (IOmM Tris, 2mM EDTA, pH8. O, l%Triton X-100)缓冲液中。离心过程重复3次。操作过程保持低温下进行。最后留取沉淀，溶于少量Tris-EDTA(O. IM Tris,O. ImM EDTA，pH7. 8) buffer 中，4°C保存备用。2. SDS-PAGE 及电镜鉴定提取的鞭毛蛋白进行SDS-PAGE电泳。5%积层胶，10%分离胶，120V电压，电泳至胶底部。凝胶用考马斯亮蓝法染色，脱色后凝胶成像分析系统观察結果。见图I。副溶血性弧菌菌体及单生鞭毛电镜结果如图2所示。用无菌去离子水离心洗涤两次菌体，悬浮，取一滴于铜网上，磷钨酸负染，晾干，透射电镜观察。鞭毛蛋白电镜采用相同方法，见图3。3.动物的免疫(I) BALB/c小鼠的免疫以鞭毛蛋白为抗原，免疫61周龄的BALB/c小鼠5只，设2只不作免疫小鼠做阴性对照。初次免疫抗原加等量福氏完全佐剂充分乳化后，皮下注射免疫小鼠，40 μ g/小鼠。以后每隔两周用相同剂量抗原与福氏不完全佐剂充分乳化后免疫。第五次免疫:Γ5天后尾静脉采血，检测抗血清效价。(2)新西兰纯种兔的免疫用副溶本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曾静，魏海燕，张蕾，张西萌，
申请(专利权)人：北京出入境检验检疫局检验检疫技术中心，
类型：发明
国别省市：
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