一种结合分子。本发明专利技术涉及经历了亲和力成熟的功能性仅有重链的抗体多样性库的制造及其用途。本发明专利技术也涉及类别特异性仅有重链的抗体多样性库的制造和用途，也涉及具有抗体重链功能性优选抗体重链结合功能性、恒定区效应子活性及任选其他效应子功能的多价多肽复合物的制造和用途。本发明专利技术还涉及在转基因小鼠中响应抗原激发产生全功能性仅有重链的抗体的方法。本发明专利技术特别涉及产生任何种类的人抗原特异性、高度亲和力、仅有重链的抗体或多种混合物的方法，以及分离及表达全功能性VH抗原结合域的方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及经历了亲和カ成熟的功能性仅有重链的抗体多样性库(diverserepertoire)的制造及其用途。本专利技术也涉及类别特异性仅有重链的抗体多样性库的制造和用途，也涉及具有抗体重链功能性优选抗体重链结合功能性、恒定区效应子活性及任选其他效应子功能的多价多肽复合物的制造和用途。本专利技术也涉及在转基因小鼠中响应抗原激发产生全功能性仅有重链的抗体的方法。本专利技术特别涉及产生任何种类的人抗原特异性、高度亲和力、仅有重链的抗体或多种混合物的方法，分离及表达全功能性VH抗原结合域的方法。本专利技术也涉及产生包含重链功能性优选重链效应子活性及其他结合和效应子功 能的多价多肽复合物。也描述了使用本专利技术方法产生的仅有重链的抗体及其他多价结合复合物及其用途。
技术介绍
在21世纪开发的新药中将存在很大比例的单克隆抗体或其变异体。单克隆抗体治疗已经被公认为优选途径用于治疗类风湿性关节炎和克罗恩病且在癌症治疗中有很大进展。用于治疗心血管疾病及感染性疾病的基于抗体产品也在开发之中。单克隆产品识别并结合靶配体(例如TNFa)上単一、明确的表位。用于治疗的人单克隆抗体的制造依然依赖于哺乳动物细胞培养。装配包括两个重链和两个轻链的复合体(H2L2复合体)及接着翻译后糖基化过程排除使用的细菌体系。通过哺乳动物细胞培养制造抗体的生产成本和资金耗费高且在缺乏可接受的其它疗法时有限制基于抗体的疗法潜力的风险。许多种转基因生物能够表达全功能性抗体。包括植物、昆虫、雏鸡、山羊和牛，但是仍然没有用于制造销售的治疗性产品。可在大肠杆菌(E. coli)中制造功能性抗体片段但是除非在制造过程中进行聚こニ醇化否则产物在血清中稳定性通常较低。双特异性抗体复合物是基于工程Ig能够结合相同或不同抗原上两种不同表位的分子。双特异性结合蛋白単独或与其他结合剂联用參入抗体显示有希望的治疗模式即获得人免疫功能而具治疗效果，例如清除病原体(Van Spriel等，(1999) J. Infect. Diseases,179,661-669 ;Tacken 等，(2004) J. Immunol.，172，4934-4940 ;美国 5，487，890)、癌的治疗(Olennie和 van der Winkel, (2003)Drug Discovery Today, 8, 503-5100)和免疫治疗(VanSpriel 等,(2000) Immunol. Today, 21, 391-397 ;Segal 等,(2001) J. Immunol. Methods, 248，1-6 ;Lyden 等，(2001) Nat. Med.，7，1194-1201)。制造方面问题的复杂性在于双特异性抗体产物以两种或多种H2L2复合体为基础。例如两套或多套重链和轻链基因的共同表达可致形成高达10种不同的组合，其中仅有一种为所需的异源ニ聚体(Suresh 等，(1986)Methods EnzymoL, 121, 210-228)。为解决这种问题，开发了许多方法生产保留重链效应子功能的哺乳动物细胞全长双特异性IgG形式(BsIgG)。BsIgGs需要工程的"杵臼结构(knob and hole)"重链以防止异源ニ聚体形成且利用相同L-链来避免L-链错配(Carter, (2001) J. Immunol.Methods，248，7-15)。也已经描述了可选择的化学交联方法自各自识别不同抗原的抗体片段制备复合体(Ferguson 等，(1995) Arthritis and Rheumatism, 38,190-209)或将其他结合蛋白例如胶原凝集素交联到抗体片段制备复合体(Tacken等，(2004) J. Immunol. , 172,4934-4940)。开发通常缺乏重链效应子功能的双抗体或微型抗体(BsAb)也克服异源ニ聚体过剩。这些包含參入VH和VL结合位点(scFv)的极微小单链抗体随后折叠(fold)并ニ聚化(dimerise)从而形成ニ价双特异性抗体,对其姆个祀抗原为单价(Holliger等，(1993)PNAS，90，6444-6448 ;Muller 等，(1998)FEBS Lett.，422，259-264)。在一个实例中，CHl和L-恒定域用作形成双特异性微型抗体的异源ニ聚化域(Muller等，(1998)FEBS Lett., 259-264)。已经开发了许多基于E. coli表达体系的重组方法产生BsAbs (Hudson，(1999)Curr. Opin. Immunol. , 11, 548-557),可是生产临床阶段多价抗体材料的花费和规模看来仍是其临床开发的首要障碍(Segal 等,(2001) J. Immunol. Methods, 248,1-6)。近来，BsAb概念已经扩展到包括双-双抗体、四价的双特异性抗体，其中在各H链和L链上的Vh和\域已经被scFv结合域的工程对(engineered pairs)取代。虽然这类构建体的基因工程(engineer)方面的难度很大，但仍可在培养的哺乳动物细胞中装配这种构建体而不出现过剩异源ニ聚体(Lu等，(2003) J. Immunol. Methods, 279, 219-232)。本领域中已经熟知免疫球蛋白结构。大多数天然免疫球蛋白包含两个重链和两个轻链。重链通过大约位于每个重链中间的铰链域之间的双硫键互相结合。轻链与每个重链在铰链域N末端一侧上结合。每个轻链通过铰链域附近双硫键正常键合到其各自重链。当Ig分子正确折叠吋，每个链折叠成许多由更线性多肽序列结合的特殊球状区域。例如轻链折叠成可变域(\)和恒定域(CJ。重链有邻近轻链可变域的单一可变域VH、第一恒定域、铰链域和两个或三个另外的恒定域。重链(Vh)和轻链可变域的相互作用导致抗原结合区(Fv)形成。通常Vh和ん都需要抗原结合，尽管重链ニ聚体和氨基末端片段在没有轻链时仍显示保留有活性(Jaton等，(1968) Biochemistry，7，4185-4195)。随着新分子生物学技术的发展，在人B细胞増殖性疾病(重链疾病)和鼠模型系统中鉴别出仅有重链的抗体(缺乏轻链)的存在。重链疾病分子水平分析显示基因组水平的突变和缺失可导致重链ChI域不适当的表达，引起仅有重链而缺乏结合轻链活性的抗体表达(參见 Hendershot 等，(1987) J Cell Biol. , 104, 761-767 ;Brandt 等，(1984)MoLCell. Biol.，4，1270-1277)。对得自噬菌体文库的分离的人Vh域単独研究显示Vh域的抗原特异性结合但是这些Vh域证明溶解度低。而且建议选择具噬菌体阵列上展示的特异性结合性质的人Vh域可形成工程抗体结构单兀(Ward等，(1989) Nature, 341, 544-546)。使用其他脊椎动物物种研究显示作为天然基因突变结果的骆驼(camelids)产生功能性仅有IgG2和IgG3重链ニ聚体，由于缺乏ChI轻链结合区其不能结合轻链(HamersCasterman等，(1993)Nature, 363,446-448)及例如S鱼的物种产生仅有重链样(heavy chain-only本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：罗杰·金登·克雷格，F·G·格洛斯费尔德，R·W·杨森斯，D·德拉贝克，
申请(专利权)人：伊拉兹马斯大学鹿特丹医学中心，罗杰·金登·克雷格，
类型：发明
国别省市：
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