通过质谱分析的手段鉴定至少一种微生物的方法技术

本发明专利技术涉及鉴定样品中至少一种微生物的方法，所述方法包括鉴别所述至少一种微生物及确定分型、对于至少一种抗微生物剂的潜在抗性、及毒力因子的性质，特征在于对于所述至少一种微生物的分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质所进行的确定是通过质谱分析实施的，通过使用蛋白质、肽和/或代谢物作为所述分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质的标记。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本专利技术涉及微生物学领域。本专利技术更特别是涉及使用质谱分析从样品中鉴定微生物。自从巴斯德发现了微生物，已经通过显微镜和生物化学分析对微生物进行了研究。这些常规方法通常费时且费力，很快就有需要寻求分析性的替代手段。因此，早在1975年J. Anhalt and C. Fenselaut1]就开始通过质谱分析对细菌进行分析。这些初步的研究之后是通过气相色谱结合质谱分析(GC-MS)对微生物壁脂肪酸进行研究[2]。这种方法以FAME(脂肪酸甲酯)的名称普及。其目前是分类学研究的一种参考方法。然而，其使用仍限于某些掌握了经皂化、水解和衍生化而对样品进行处理的专门实验室，。在1996 年，M. Claydon et al. [3]和 T. Krishnamurthy and P. Ross[4]的研究显不使用MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight)型质谱分析仪鉴别各种细菌物种的可能性。该分析组合质谱分析的结果并通过专业软件解释。其极其简便且可以在几分钟内进行。然而，其仅在最近在医学检验实验室中展开使用。其临床应用目前限于鉴别细菌和酵母的物种。其既未用于分型(typing)也未用于鉴别抗微生物剂抗性，也未用于分析毒力。然而，微生物的鉴别在临床和工业领域均是重要的。因此，例如，鉴别对于微生物剂如抗生素的抗性及检测毒力因子是保证患者最佳治疗的必要条件。同样，分型对于流行病学研究及对于对抗医院内感染是关键因素。已经提议其它质谱分析方法、特别是串联质谱分析法以符合这些需要。例如可以提及的是c. Fenselau等使用四极-TOF(Q-TOF)鉴别0 -内酰胺酶te], D. Ding等用三节四极质谱仪检测葡萄球菌肠毒素C2 (毒力因子SEC2)[7]，或者R. Everley等用Q-TOF对梭菌(Clostridium)进行分型[8]。然而，这些研究结果不能应用于常规的临床应用。研究仪器需要高度专业的技术人员。分析时间通常超过I小时/样品，与微生物检验实验室的工作量不相匹配。最后，各个小组所获得的数据是应对特定的问题，但却并不同时应对所有的临床需要。最近，S. Hofstadler等提出一种方法，其符合所有临床需求的要求[9]。其组合了通过PCR扩增微生物基因组及通过电喷雾-TOF (ESI-TOF)检测PCR产物。这种方法目前是完全自动化的[1°]。然而，其需要PCR扩增，PCR扩增具有分子生物学中的固有缺陷，即探针的成本、提取收率等。在本文中，本专利技术的目的是提出一种鉴定微生物的方法，即鉴别并且确定分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质，使得可以克服现有方法的缺点，即提供这样一种方法，该方法成本较低、不用特异于每个物种的试剂，特别是与分子生物学方法相比 提供少于I小时的短时间结果，且可以在临床常规使用，不需要高度专业的技术人员。另夕卜，鉴定微生物的整个方法可以用同一质谱分析仪有利地进行，从而简化了微生物检验实验室的设备。为此，本专利技术提出一种在样品中鉴定至少一种微生物的新方法，该方法包括鉴别所述至少一种微生物并且确定分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性及毒力因子的性质，特征在于确定所述至少一种微生物的分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质是通过质谱分析进行，使用蛋白质、肽和/或代谢物作为所述分型、对于至少一种抗微生物剂抗性及毒力因子的性质的标记。因此，本专利技术的方法是，微生物的至少三种性质的鉴定是通过质谱分析技术进行的，使用代表待鉴定的微生物的蛋白质、肽或代谢物作为标记。可以通过本专利技术的方法鉴定的微生物是在工业和临床上遇到的所有病原性或非病原性微生物。它们可以是细菌、病毒、原生动物或酵母。短语“分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质的标记”是指蛋白质或者代谢物来源的分子，其是所述性质的特征。短语“对微生物分型”是指区分同一物种内的一些菌株。分型具有流行病学意义；临床医生获知分离自患者的菌株与表面上相同并分离自其它患者或环境的其它菌株是否来自同一来源。这样因而可以揭示在医院内感染的场所或者食物中毒的时间。在细菌中分型性质的标记的非限制性实例是具有特征性突变的肽，如大肠杆菌(Escherichiacoli)的adk、fumC、gyrB、icd、mdh、purA和recA基因的转录产物，以及金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的 arc、aroE、glpF、gmk、pta、tpi 和 yqiL 基因的那些转录产物。在原生动物中分型性质的标记的非限制性实例是溶组织内阿米巴(Entamoebahistolytica)和迪斯帕内阿米巴(E. dispar)的几丁质酶基因产物。在病毒中分型性质的非限制性实例是人免疫缺陷病毒的聚合酶基因产物。最后，在酵母中分型性质的标记的非限制性实例是白色念珠菌(Candida albicans)的 aatla、accl、adpl、mpib、syal、vpsl3 和zwflb基因片段的转录产物。短语“确定对至少一种抗微生物剂的抗性”是指确定微生物对于抗微生物剂破坏的易感性。因此，如果微生物是细菌，其所针对而产生抗性的抗微生物剂是抗生素，如果是原生动物，所述抗微生物剂是抗寄生虫剂，如果是病毒，所述抗微生物剂是抗病毒剂，如果是酵母，所述抗微生物剂是抗真菌剂。参与抗性机制的蛋白质根据科和物种而有所不同。在细菌中使用的对于至少一种抗生素抗性的标记的非限制性实例是金黄色葡萄球菌的mecA基因的转录产物，赋予甲氧西林抗性，且使得可以显示出菌株是否是甲氧西林抗性的(MRSA菌株)还是甲氧西林敏感的(MSSA菌株)。也可以提及的是TEM-2蛋白质，其可以示出大肠杆菌菌株对于青霉素是否是抗性的，但是对于其它类抗生素如先锋霉素族抗生素或碳青霉烯类(carbapenems)敏感。另一标记是称作KPC(对于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)碳青霉烯酶(carbapenemase))的酶，其赋予对碳青霉烯类的抗性。金黄色葡萄球菌的抗性标记的另一实例是表达万古霉素抗性的代谢形式，如E. Alexander etal., in the poster〃Metabolomics_based approach to antibiotic resistance inStaphyloccocus aureus ^presented at the ASMS conference, 2009 描述。原生动物中使用的至少一种抗寄生虫剂抗性的标记的非限制性实例是含铁超氧化物歧化酶(Fe-SOD)和过氧化氧还蛋白(peroxyredoxin),其增加的表达赋予甲硝唑(metronidazole)抗性。在病毒中使用的至少一种抗病毒剂抗性的标记的非限制性实例是人免疫缺陷病毒逆转录酶的突变，赋予对逆转录酶核苷抑制剂的敏感性降低。最后，酵母中使用的至少一种抗真菌剂抗性的标记的非限制性实例是白色念珠菌1，3-b-D-葡聚糖合成酶的突变，其赋予对棘球白素(echinocandins)敏感性降低。另一实例是在白色念珠菌中唑类抗真菌剂的抗性，特别是氟康唑(fluconazole)抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.10.15 FR 09572181.从样品中鉴定至少一种微生物的方法，包括鉴别所述至少一种微生物以及确定分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性及毒力因子的性质，特征在于对所述至少一种微生物的分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质所进行的确定是通过质谱分析实施的，使用蛋白质、肽和/或代谢物作为所述分型、对至少一种抗微生物剂抗性及毒力因子的性质的标记。2.权利要求I的鉴定至少一种微生物的方法,特征在于对于分型、对至少一种抗微生物剂的潜在抗性及毒力因子的性质所实施的质谱分析是MS/MS型的质谱分析。3.权利要求2的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述MS/MS质谱分析是MRM。4.权利要求1-3任一项的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对于分型、对至少一种抗微生物剂的抗性及毒力因子的性质所进行的确定是在相同的质谱分析装置中实施的。5.权利要求4的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对于分型、对至少一种微生物 的抗性及毒力因子的性质所进行的确定是同时实施的。6.前述任一项权利要求的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于鉴别所述至少一种微生物也是通过质谱分析实施的。7.权利要求6的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于鉴别所述至少一种微生物的质谱分析是MS型、MS/MS型、或者MS型及随后MS/MS型的质谱分析。8.前述任一项权利要求的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于其包括证实所述至少一种微生物的鉴别的额外步骤，所述证实步骤是通过质谱分析实施的。9.权利要求8的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述证实步骤中的质谱分析是MS/MS型的质谱分析。10.权利要求9的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述证实步骤中的质谱分析是 MRM。11.前述任一项权利要求的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述分型、对至少一种抗微生物剂抗性及毒力因子的性质的标记是所述至少一种微生物的蛋白质。12.权利要求11的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述微生物的蛋白质被消化成肽。13.权利要求12的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述消化是用酶来进行的。14.权利要求13的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述酶是胰蛋白酶。15.前述权利要求的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于所述至少一种微生物是细菌，并且所述抗微生物剂是抗生素。16.权利要求15的鉴定至少一种微生物的方法,特征在于所述细菌是金黄色葡萄球菌(Stphylococcus aureus)。17.权利要求16的鉴定至少一种微生物的方法，特征在于对分型性质的确定是使用具有 SEQ ID No. 2、3、4、5、6、7、8、10、11、12、13、14、15、16、17、19、20、21、23、24、26、27、29、30、32、34、35、37、38、40、42、44或45所示序...

【专利技术属性】
技术研发人员：C·博利厄，Y·沙勒捷，JP·沙里耶，S·沙泰利耶，P·迪富尔，C·弗兰切斯基，V·吉拉德，S·庞斯，
申请(专利权)人：生物梅里埃公司，
类型：发明
国别省市：