本发明专利技术一般而言有关于一种使用微型核糖核酸(miRNA)及其小发夹型核糖核酸(shRNA)同源物/衍生物来发展新颖的抗肿瘤/癌症药物、疫苗与治疗的设计及方法。具体而言，本发明专利技术有关于使用一核酸组合物，该核酸组合物在被传送到人类细胞内之后，能表达类mir-302基因沉默效应子而沉默mir-302标的的细胞周期调节子与致癌基因，产生抑制肿瘤/癌细胞生长及转移的作用。Mir-302是在人类胚胎干(hES)细胞及诱发型多能性干(iPS)细胞中发现到的最主要的微型核糖核酸(miRNA)，然而其功能尚不清楚。本发明专利技术证实了在人类细胞中，mir-302同时抑制细胞周期蛋白-E-CDK2及细胞周期蛋白-D-CDK4/6路径，最终抑止超过70％的G1-S期的细胞周期转换。同时，mir-302亦沉默肿瘤干细胞标记，BMI-1，并接着增进p16Ink4a及p14/p19Arf在抑制由CDK4/6所调解的细胞增生上的肿瘤抑制功能。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】普适性抗癌药物及疫苗的开发专利技术人林希龙和吴堂熙要求的优先权本专利技术要求以2009年8月26日提交的申请序列号为61/272，169、标题为“用体细胞核转移技术(SCNT)使Mir-302重新编程体细胞具有高度多能性的干细胞性以及化学重新编程的应用”的美国临时申请为其优先权。本专利技术还要求以2010年8月12日提交的申请序列号为61/323，190、标题为“Mir-302通过共同抑制CDK2和CDK4/6途径抑制人类iPS细胞肿瘤发生”的美国临时申请为其优先权。本申请是以下申请的部分继续申请2008年5月7日提交的申请序列号为12/149，725、标题为“使用内含子RNA生成人类类胚胎干细胞”的美国专利申请；2009年I月8日提交的申请序列号为12/318，806、标题为“使用可诱导的重组核糖核酸因子生成不含肿瘤的类胚胎干细胞的多能性细胞”的美国专利申请。这些申请以其全部内容引入本文作为參考。
本专利技术一般而言关于用于癌症治疗的有治疗功能的DNA/RNA药物和/或疫苗的设计及利用。更明确言之，本专利技术关于设计及使用一核酸组合物的设计和方法，其中该核酸可产生和表达小型核糖核酸(small RNA)基因沉默效应子，沉默mir-302标的的细胞周期调节子与致癌基因，进而对肿瘤/癌细胞的生长及转移产生抑制作用。小型核糖核酸基因沉默效应子较佳包含微型核糖核酸(microRNA, miRNA),像是mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d、mir-302e、微型核糖核酸前体(前体微型核糖核酸，pre-miRNAs)和人造重设的小发夹型核糖核酸/小干扰核糖核酸(shRNA/siRNA)的同源物/衍生物，以及其组合。感兴趣的该等人类细胞包括体外(in vitro)、离体(ex vivo)及/或体内(in vivo)的体细胞或肿瘤/癌细胞。背景技木Mir-302是在人类胚胎干细胞(human embryonic stem, hES cell)及诱发型多能性干细胞(induced pluripotent stem, iPS cell)中发现到的最主要的微型核糖核酸(microRNA, miRNA),然而其功能尚不清楚。先前的研究已显示mir-302的异位表达能将人类癌细胞重新编程为似hES的多能性细胞，其具有明显缓慢的细胞周期速率以及似休眠细胞的细胞型态(Lin等人，2008)。相对静止是这些由mir-302重新编程而成的多能性干细胞(mirPS)的ー项清楚的特征；然而，以其它三/四个因子(即0ct4-Sox2-Klf4-c-Myc或0ct4-Sox2-Nanog-Lin28)诱发而得的多能性干细胞(iPS)则具有另人注目的增生能力及不可挡的肿瘤生成倾向(Takahashi等人,2006 ;Yu等人,2007 ;Wernig等人,2007)。存在于mirPS细胞的抗增生特性背后的机制尽管大部分仍不甚清楚，我们发现两个mir-302标的的Gl检控点调节子(Gl-checkpoint regulators)可能參与其中，他们是细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)及细胞周期蛋白D，(Lin等人，2008)。真核细胞细胞周期的进行是经由细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的活化来驱动的，细胞周期蛋白依赖性激酶与正调节次単元(subunits):细胞周期蛋白，以及负调节子细胞周期蛋白依赖性激酶抑制子(CKI，像是 pl4/pl9Arf、pl5Ink4b、pl6Ink4a、pl8Ink4c、p21Cipl/ffaf I 与 p27Kipl)形成功能性复合体。在哺乳动物细胞中，不同的细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖性激酶复合体參与调节细胞周期中不同时期的转换，像是參与Gl期行进的细胞周期蛋白-D-CDK4/6、Gl-S期转换的细胞周期蛋白-E-CDK2、S期行进的细胞周期蛋白-A-CDK2，以及參与M期进入的细胞周期蛋白A/B-⑶C2(细胞周期蛋白-A/B-⑶Kl)。由此推測，mir-302的抗增生功能是由于CDK2及细胞周期蛋白D在Gl-S期转换期间被共同抑制的結果。然而，在有关人类mir-302类似物小鼠mir_291/294/295家族的研究中，显示其与人类mirPS细胞内的mir-302的功能全然不同的結果。在小鼠胚胎干细胞(mES)中，mir-291/294/295的异位表达透过直接沉默p21Cipl (又名CDKN1A)与丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶Lats2 (Wang等人,2008)引发细胞快速增生以及Gl-S期转换。该肿瘤倾向(tumor-prone)的结果被认为是由于p21Cipl及Lats2肿瘤抑制子的天性使然。缺乏p21Cipl/ffafl的基因的转基因小鼠在缺乏Gl检控点的控制下能表现正常的发展(Deng等人，1995)。然而，由于Lats2在有丝分裂开始时具有征召入-微管蛋白(gamma-tubulin)及參与纺锤体形成等功能，因此其角色仍待理清。此外，小鼠胚胎中Lats2的缺乏已被发现会导致严重的有丝分裂缺陷且具致命性，此亦指出Lats2的沉默会阻碍而非促进细胞分裂(Yabuta等人，2007)。综合来说，p21Cipl的沉默似是mir-291/294/295诱导的肿瘤生成背后的主要机制。然而，我们近来在审查人类p21Cipl基因的mir-302标的位的结果，是阴性的。同样阴性的结果亦可由在线演算程序TARGETSCAN(http://www. tarRetscan. ors/)及 PICTAR_VERT(http://pictar. mdc-berlin. de/)预测而得。因此，mir-302 及其类似物，mir-291/294/295很可能在hES和mES细胞中各具有不同的功能，而导致人类iPS及小鼠iPS细胞不同的特性。在以上发现的启发下，吾人可以理解mir-291/294/295在mES细胞中的角色不能作为评估mir-302在hES及iPS细胞内的功能的等效模型。MiRNA是细胞质中的抑制子(inhibitor)，其通常的功能为抑制与其高度互补的标的基因转录物(mRNAs)的翻译。MiRNA与标的基因结合的严谨度决定了该miRNA的真正功能。依据细胞条件的不同，miRNA在基因标的偏好上也会有不一样的表达。然而，至目前并没有与mir-302的浓度效应或mir-302与标的基因交互作用的严谨度相关的报告。为解答此疑问，本专利技术揭露其中重要的细节并首次掲示mir-302在人类及小鼠细胞中的功能非常不同。在人类细胞中，mir-302強烈地标的CDK2、细胞周期蛋白D1/D2、以及BMI-1，但有趣的是，不包含p21Cipl。与小鼠p21Cipl不同，人类p21Cipl不含任何mir-302的标的位。基因标的上的不同导致两者在细胞周期调节上的重要分岐(schism)。在小鼠胚胎干细胞(mES)中，mir-302沉默p21Cipl并且促进似肿瘤(tumor-like)的细胞增生(Wang等人,2008 ；Judson，2009)，然而在人类mirPS细胞中，p21Cipl依然维持表达并导致较缓慢的细胞增生与较低的肿瘤生成能力。此外，小鼠的BMI-I也因缺乏适当的标的位，因此本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.08.26 US 61/272,169;2010.04.12 US 61/323,1901.ー种使用重组核酸组合物在标的细胞中引发特定的基因沉默效应的方法，其包含下列步骤 (a)提供该重组核酸组合物，其被传送、被转录及被加工成至少一基因沉默效应子，以干扰复数个mir-302标的的细胞基因；以及 (b)以该重组核酸组合物处理含有该标的细胞并且表达mir-302标的的细胞周期调节子及致癌基因的细胞底物。2.如权利要求第I项所述的方法，其中该标的细胞包含人类细胞，该人类细胞的分类属于发现于畸胎瘤当中的肿瘤细胞类型。3.如权利要求第I项所述的方法，其中该标的细胞包含源自癌组织的人类细胞。4.如权利要求第I项所述的方法，其中该重组核酸组合物包含表达胜任载体。5.如权利要求第I项所述的方法，其中该重组核酸组合物包含药物诱导式基因表达启动子。6.如权利要求第5项所述的方法，其中该药物诱导式基因表达启动子受到四环霉素衍生物或同等物的控制。7.如权利要求第I项所述的方法，其中该重组核酸组合物包含组成型基因表达启动子。8.如权利要求第7项所述的方法，其中该组成型基因表达启动子受第二型RNA聚合酶或其同等物所驱动。9.如权利要求第7项所述的方法，其中该组成型基因表达启动子为病毒启动子。10.如权利要求第I项所述的方法，其中该细胞底物表达复数个mir-302标的的细胞基因。11.如权利要求第I项所述的方法，其中处理该细胞底物是在mir-302标的的细胞基因受到抑制的条件下进行。12.如权利要求第I项所述的方法，其中该重组核酸组合物包含5’端剪接供体位、内含子插入位、分支点基序、多嘧啶段，以及3’端剪接受...
【专利技术属性】
技术研发人员：林希龙，吴堂熙，
申请(专利权)人：林希龙，吴堂熙，
类型：发明
国别省市：
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