一种检测喹噁啉-2-羧酸的检测试剂盒及其方法技术

本发明专利技术公开了一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒及其检测方法，由多孔包被板，缓冲液，喹噁啉-2-羧酸标准，喹噁啉-2-羧酸的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。通过测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。本发明专利技术具有结构简单、组装容易、耐腐蚀、重量轻、成本低、适用面广等特点，阀芯对中性能好，运动灵活可靠，能够起到良好的堵水效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物检测领域，具体的说，涉及。
技术介绍
卡巴氧作为抗菌促生长剂，广泛应用于畜禽养殖，能促进动物生长、提高饲料转化率、预防和控制猪痢疾和细菌性肠炎。代谢研究和毒理学研究表明，卡巴氧在猪体内迅速转化成脱ー氧和脱ニ氧化合物，其原形和脱氧化合物对人和动物有一定的毒性作用，主要表现为诱癌性、致突变作用、繁殖毒性。因此，1999年欧盟禁止卡巴氧在食品动物中应用， 2001年加拿大也颁布法令禁止卡巴氧在市面上销售，2003年食品添加剂联合专家委员会(JECFA)对卡巴氧进行了再评价，委员会决定对卡巴氧撤销其最大残留限量(MRLs)，该残留限量由JECFA于1999年规定，肌肉和肝脏分别为5和30 ii g/kg。喹噁啉_2_羧酸是卡巴氧在猪体内最稳定的代谢产物，被欧盟法定为卡巴氧在猪食用组织中的残留标识物。目前在动物性食品中喹噁啉-2-羧酸的分析检测方法有很多，包括高效液相色谱法(HPLC)、液质连用(LC-MS)、气质连用(GC-MS)和ELISA。仪器检测主要存在仪器购置费用昂贵、样品前处理复杂、程序繁琐费吋、检测费用高、不能现场操作等缺陷，所以在生产中应用受到限制。而时间分辨荧光免疫分析法(TR-FIA)由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对喹噁啉-2-羧酸残留检测的时间分辨荧光免疫分析法的专利和文献报道。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一种动物可食性组织中喹噁啉-2-羧酸残留的检测喹噁啉-2-羧酸的检测试剂盒。本专利技术的目的之ニ在于提供一种动物可食性组织中喹噁啉-2-羧酸残留的时间的分辨荧光免疫检测用方法。本专利技术目的之一是这样实现的一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其关键在于由多孔包被板，缓冲液，喹噁啉-2-羧酸标准，喹噁啉-2-羧酸的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。本专利技术目的之ニ是这样实现的一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其关键在于(I)将喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原；(2)将喹噁啉-2-羧酸与卵清蛋白偶联，得到包被原；(3)用步骤(I)的免疫原免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗QCA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(4)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化，获得抗QCA的单克隆抗体IgG ；(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱浄化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；(7)将步骤(6)的待检物进行測量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。上述的固相载体是多孔包被板，采用48或者96孔的多微孔包被板作为固相载体。上述的衍生试剂是丁胺。上述的催化剂剂是腈基磷酸ニこ酷。 上述步骤(6)和(7)具体为取包被有QCA-OVA的微孔包被板，加入50 yl的QCA-ABA或处理好的样品到各自的微孔中，加50 ill以缓冲液稀释的喹噁啉_2_羧酸抗体，25 0C 37°C振荡0. 5^1小时，洗涤液洗三次，加以缓冲液稀释的100 ill Eu3+-羊抗鼠抗体，250C 37°C振荡0. 5^1小时，用洗涤液洗六次，加200 U I增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，从标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。本专利技术主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测喹噁啉-2-羧酸。采用时间分辨荧光免疫的技术主要有两个方面第一，特异性单抗隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫原免疫小鼠,通过杂交瘤技术,得到分泌抗QCA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用Protein G柱进行纯化,获得抗QCA的单克隆抗体IgG。第二, Eu3+标记抗体的制备。本专利技术測定方法測定的基础是标记免疫反应。包被有QCA-OVA的多孔板，加入QCA-ABA或已处理好的样品到各自的微孔中，再加入抗喹噁啉-2-羧酸抗体，振荡反应，游离的喹噁啉-2-羧酸与微孔板上的QCA-OVA竞争喹噁啉-2-羧酸抗体，洗涤液洗涤，没有连接的喹噁啉-2-羧酸抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3+-羊抗鼠抗体，进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu3+-羊抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外光的激发下发射很强的突光，用时间分辨突光仪测定其突光强度cps,突光強度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中喹噁啉-2-羧酸的量。有益效果本专利技术检测方法不需要昂贵的仪器，样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，同时具有检测特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点。附图说明图I为本专利技术的喹噁啉-2-羧酸标准品与抗体的TR-FIA标准抑制曲线图。实施例I喹噁啉-2-羧酸(QCA-载体蛋白偶联物的制备免疫原(QCA-BSA)的合成准确称取喹噁啉_2_羧酸348mg溶解在2mLN，N- ニ甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入Y-氨基丁酸溶液，搅拌反应3h，调节反应液pHIO左右。离心除掉沉淀物。将上述反应物逐滴加入BSA溶液中(340mgBSA溶于5mL生理盐水)，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 23mg，N，N-ニ环已基碳ニ亚胺(DCC) 43. 4mg，4°C反应过夜，离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液(PBS)透析3d，每6h更换透析液，将所得产物低压冻干，于-20°C保存备用。免疫原(QCA-OVA)的合成准确称取喹噁啉_2_羧酸348mg溶解在2mLN，N- ニ甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入Y-氨基丁酸溶液，搅拌反应3h，调节反应液pHIO左右。离心除掉沉淀物。将上述反应物逐滴加入OVA溶液中(230mg OVA溶于5mL生理盐水)，再加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 23mg，N，N-ニ环已基碳ニ亚胺(DCC) 43. 4mg，4° C反应过夜，离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液(PBS)透析3d，每6h更换透析液，将所得产物低压冻干，于-20°C保存备用。2抗喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体制备2. 1动物免疫用实施例I制备的免疫原(QCA-BSA)分别免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100iig/0. 2mL。首次免疫，用无菌O.Olmol/L pH7. 4PBS溶解免疫原，再与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化，颈背部皮下分2 3点注射；加强免疫，用0. Olmol/L PH7.4PBS溶解免疫原与等量弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次间隔14 21(1，第3次免疫后7 10d开始对免疫小鼠尾静脉采血，收集血清，用ELISA检测小鼠血清效价。末次免疫后间隔4周以上，在细胞融合前3 4d，腹腔注射QCA-BSA抗原100 u g/0. 2mL/只，注射后每天注意观察，保证融合前小鼠状态良好。2. 2抗喹噁啉-2-羧酸单克隆抗体制备分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免疫睥细胞。取I只免疫的Balb/c小鼠，从眼眶放血分离血清作为阴性血清，处死。小鼠用75%酒精中浸泡5min，进行整体消毒。将小鼠四肢本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒，其特征在干由多孔包被板，缓冲液，喹噁啉-2-羧酸标准，喹噁啉-2-羧酸的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。2.ー种根据权利要求I所述检测喹噁啉-2-羧酸的时间分辨荧光免疫分析法试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其特征在于 (1)将喹噁啉-2-羧酸与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原； (2)将喹噁啉-2-羧酸与卵清蛋白偶联，得到包被原； (3)用步骤(I)的免疫原免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗QCA的单克隆抗体的杂交瘤细胞株； (4)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗QCA的单克隆抗体IgG ； (5)用步骤(2)的包被原包被固相载体； (6)将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱浄化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物； (7)将步骤(6)的待检物进行測量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的喹噁啉-2-羧酸含量。3.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：乐涛，贾渝跃，何红秋，李滨，牛小东，陈雍，王玉，段小炼，秦建波，
申请(专利权)人：重庆市科学技术研究院，
类型：发明
国别省市：