本发明专利技术公开了用于检测白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水乙醇、ReverTraAceqPCRRTKit、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于：检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRDqPCRMIX、检测目的基因用上下游引物m-bcr-F，m-bcr-R，探针m-bcr-Probe，检测内参基因Abl用引物为abl-F，abl-R，探针abl-Probe；其中，m-bcr-F:GGCGCCTTCCATGGAGAC；m-bcr-R:TCCTTGGAGTTCCAACGA；m-bcr-Probe:TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAA；abl-F:GCCGTGAAGACCTTGAAGGAG；abl-R:ATGATATAGAACGGGGGCTC；abl-Probe:FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG-TAMRA。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属生命科学和生物
，特别是ー种基因检测试剂盒，采用探针实时荧光定量PCR技术，能够对人类急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)以及少数慢性粒细胞白血病(CML)患者体内BCR/ABL(m-bcr)融合基因表达水平进行检测，可有效的节约检测时间，提闻检测精度。
技术介绍
白血病是ー类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。其克隆中的白血病细胞失去进一歩分化成熟的能力而停滞在细胞发育的不同阶段。在骨髄和其他造血组织中白血病细胞大量增生积聚并浸润其他器官和组织，同时使正常造血受抑制，临床表现为贫血、出血、感染及各器官浸润症状。根据白血病细胞的成熟程度和自然病程，白血病可分为急性和慢性两大类。急性白血病病情进展迅速，自然病程仅有数周至数月。一般可根据白血病细胞系列归属分为急性髓系白血病(AML)和急性淋巴细胞白血病(ALL)两大类。而慢性白血病的发生是由于有功能的已分化成熟细胞过度增生，因此慢性白血病是ー种由于信号传导不良或细胞增殖失控所至的疾患，而非成熟障碍所至。慢性白血病常见有慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。由于白血病类型不同，治疗方案及预后亦不尽相同，因此诊断成立后，应进一歩分型。关于人类白血病的病因与发病机理，至今仍未完全明了。已知病因有感染因素、电离辐射、化学物质，遗传因素及免疫功能异常等。目前认为白血病病因是以上各种因素相互作用的結果。近十余年来慢性粒细胞白血病(CML)的分子生物学研究不断有新的进展，其中之一就是陆续报道了二十余例BCR (breakpoint cluster region)基因上的断裂点小在 M-bcr unajorbreakpoint cluster regionノ 而位 T* m-ber (minor breakpointdusterregion)、表达相对分子质量为 190000 BCR/ABL 融合蛋白的 CML(P190 CML)。P190CML是ー个罕见的CML分子亚型。除了 20% -50%的Ph+ALL表达与CML—样的P210以外，50% -80%的PML-ALL患者BCR基因中的断裂点不在M_bcr内，而位于其5’端上游至少30kb处，即长70 kb的第I内含子3’端的一半序列上，这ー长35 kb的区域，最初又确定了两个片段bcr_2和bcr-3,其中bcr_3位于bcr_2的5端上游16kb,现该两个片段已统称为m-bcr或mbcrl,融合方式为ela2连接,转录成7. 5 kb或7. 0 kb的mRNA,翻译成相对分子质量为190 000或185 000的蛋白产物P190b『abl或P185bc^ab1。由于早期仅发现ALL和急性髓系白血病(AML)表达P190，因此m-bcr被称为ALL型断裂点(ALL-type breakpoint),P190被认为是特有的(ALL-specific，称为Ph+bcr-ALL或P190 ALL)或急性白血病相关的(AL-associated)。P190CML发现后不久，即有报道P210 CML患者进入加速期、急变期时也可出现P190，提示P190可能与P210 CML疾病进展有夫。后又发现70 %以上慢性期P210CML患者初诊时也可检测到数量不等的P190。因而，导致产生P190的BCR-ABL连接类型并非是Ph+AL特有的。但是P190比P210的致癌能力更高，表达更倾向于导致AL表型是无疑的。因此，从CML中筛选出P190个体对于后期的治疗显得尤为重要。在实际应用中，用于检测BCR/ABL(m-bcr)融合基因表达水平的方法主要为突光原位杂交，尽管该法较为直观，但是试验过程过于繁琐，需要的试剂种类繁多，费时费力，且试验结果需要经验丰富的专家来判读，结果判读存在较大的主观性，因而一定程度上限制了该法的应用。实时荧光定量PCR法具有较高的灵敏度和特异性，而且能对PCR进行实时检测，可准确反映患者体内BCR/ABL (m-bcr)的表达情況，节约了大量的检测时间，还避免了残留污染的发生。常见的方法有SYBR GreenI染料法，双探针杂交法以及Taqman技术等。其中SYBR GreenI由于是非饱和染料,特异性不如双探针杂交法以及Taqman法,必须通过观察溶解曲线来判断其特异性；而双探针法杂交法成本又较为昂贵。因此本研究采用实时荧光PCR技术结合Taqman探针法应用于BCR/ABL (m-bcr))的基因检测
技术实现思路
鉴于现有技术中检测BCR/ABL (m-bcr)的不足，本专利技术设计了检测内參/目的基因用引物、探针序列，用荧光定量PCR技术检测白血病BCR/ABL (m-bcr)融合基因相对表达量。通过调整两个基因的引物探针浓度及比例，优化PCR的反应体系和反应条件，开发了ー种用于检测白血病BCR/ABL (m-bcr)融合基因相对表达量的试剂盒。用于检测白血病BCR/ABL (m-bcr)融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水こ醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、检测目的基因用上下游引物m-bcr-F, m_bcr-R,探针m-bcr-Probe,检测内參基因Abl用引物为abl_F, abl_R,探针ab I-Probe ;其中，m-bcr-F GGCGCCTTCCATGGAGACm-bcr-R TCCTTGGAGTTCCAACGA m-bcr-Probe TTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAabl-F GCCGTGAAGACCTTGAAGGAGabl-R ATGATATAGAACGGGGGCTCabl-Probe :FAM-ACCTGGTGCAGCTCCTTGGG_TAMRA。所述阳性对照品分别为含有BCR/ABL (m-bcr)基因的溶液；所述阴性对照品为无BCR/ABL (m-bcr)基因的溶液。其中的ReverTra Ace qPCR RT Kit为T0Y0B0公司生产的qPCR用cDNA试剂盒产品。THUNDERBIRD qPCR MIX为T0Y0B0公司生产的定量PCR试剂，产品规格为QPS-101。使用本专利技术的试剂盒，将实时荧光PCR技术结合采用Tapman探针，可以对BCR/ABL(b3a2，b2a2)融合基因的表达水平进行检测，检测精度高，而且操作简单，可降低检测成本，节约检测时间。采用双标准曲线法，通过构建BCR/ABL(m-bcr)和内參基因abl的标准定量曲线，精确定量样本的内參基因拷贝数和BCR/ABL (m-bcr)拷贝数，相比于以往的免疫组化方法和现今的ACT法，该试剂盒具有精度高，结果便于判读等优点。加之该试剂盒将反应体系所需的引物、探针进行合理配比和优化，使实验条件达到最佳，从而省去了繁琐的条件摸索环节，大大提升了实验效率。该试剂盒经测试特异性好，灵敏度高，操作简便。有助于临床上急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性粒细胞白血病(AML)早期预防、早期诊断的辅助性指标；还可对于疑似进入慢性粒细胞白血病(CML)加速期、急变期本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于检测白血病BCR/ABL(m-bcr)融合基因相对表达量的试剂盒，包括红细胞裂解液、TRIzol、氯仿、无水こ醇、ReverTra Ace qPCR RT KU、检测体系PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品，其特征在于 检测体系PCR反应液包括THUNDERBIRD qPCR MIX、检测目的基因用上下游引物m-bcr-F, m-bcr-R,探针 m-bcr-Probe,检测内參基因 Abl 用引物为 abl_F, abl-R,探针ab I-Probe ;其中，m-bcr-F: GGCGCC...
【专利技术属性】
技术研发人员：方国伟，周晓犊，王淑一，徐建成，
申请(专利权)人：南京艾迪康医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：
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