本发明专利技术涉及通过基因工程技术改造得到的一种突变的中性植酸酶及其基因和用途，该突变的中性植酸酶氨基酸序列为SEQ?ID?NO.2，是以野生型淀粉液化芽孢杆菌DSM?1061?phyC基因为基础，利用PCR技术对其基因进行点突变获得的。本发明专利技术公开了改造的中性植酸酶及其相应的DNA序列，还公开了所述中性植酸酶的生产方法。本发明专利技术所述的突变中性植酸酶与野生酶相比，在pH?6.0～7.5下活性高出25-35％。该中性植酸酶可作为一种饲料添加剂，能有效提高动物对饲料中植酸磷的利用率。本发明专利技术所提供的突变中性植酸酶基因可用于构建表达该酶的重组菌。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于酶的基因工程和酶生化工程领域。本专利技术涉及活性提高的突变中性植酸酶，本专利技术还涉及编码该突变中性植酸酶的基因及用途。
技术介绍
磷是动物必需的ー种常量矿物元素，磷的添加对配合饲料生产成本及产品质量有重要影响。植酸酶(phytase)即肌醇六磷酸酶(myo-inositol hexaphosphatephosphohydrotase)是催化植酸及其植酸盐水解产生肌醇和磷酸(或者磷酸盐)这类酶的总称。添加植酸酶能够显著提高植物性饲料中磷的利用率，减少饲料中无机磷的添加量以及动物粪便中无机磷的排出，减轻环境的磷污染，提高畜牧生产和生态效益。目前从微生物中获得植酸酶的报道有以下三种⑴来源于大肠杆菌的双功能酶(appA)，它具有植酸酶和磷酸酶的功能，但只在酸性条件下表现出强的植酸酶活性；(2)来源于黑曲霉的酸性植酸酶(PhyA)具有较高的活性，其酶促反应的pH有效范围在4. 5-6.0之间，适用于胃呈酸性的单胃动物及少数鱼类；(3)来源于芽孢杆菌的中性植酸酶(PhyC)，最适酶促反应PH在7. 0-7. 5之间适用于消化道为中性的鲤科鱼类，可有效弥补酸性植酸酶的不足。国内外科研人员对中性植酸酶的研究主要集中于产酶菌筛选和基因工程菌的构建方面。姚斌等从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis中克隆了中性植酸酶基因，并在大肠杆菌中进行了表达，表达产物具有生物学功能但比活较原始酶下降了 30% (姚斌，袁铁铮，王元火，等.来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌的表达.生物工程学报，2001，17(1) :11-15)。陈艳等(陈艳，孙健义，赵学新，等.Bacillusamyloliquegaciens中性植酸酶基因的原核表达及蛋白纯化和性质.食品与生物技术学报，2005,24(2) :60-65.)将来源于淀粉液化芽孢杆菌的植酸酶在大肠杆菌中进行了表达，结果发现基因工程菌的植酸酶活性仅为出发菌株的I. 27倍，表达重组酶活性偏低。近年来，Rao %= (Rao DE, Rao KV, Reddy VD. Cloning and expression of Bacillus phytasegene (phy)in Escherichia coli and recovery of active enzyme from the inclusionbodies. Journal of Applied Microbiology. 2008,105 (3) :1128-1137.)在大肠杆菌中对芽孢杆菌中性植酸酶进行了高效表达，结果表明其最适PH为7. O,最适温度55°C，最大活性 16U/mg。Tung 等(Tung ET,Ma HW,Cheng C,et al. Stabilization of beta-propellerphytase by introducing Xaa—>Pro and bly—>Ala substitutions at consensuspositions. Protein Pept. Lett.，2008,15, 297-299.)运用定点突变方法对 BacillusIicheniformis植酸酶的热稳定性进行了改善,取得了较好的效果。定点突变结果表明，突变酶G117A/G266A与野生酶具有类似的米氏常数Km，催化效率keat和最适的Ca2+浓度，但是热稳定性有大幅上升。 定点突变是蛋白质工程广泛采用的技术，它是根据酶的结构、功能和作用机理等信息，在基因水平进行核苷酸突变，以达到改造酶分子中特定氨基酸残基的目的，使酶的性质最佳化。利用生物信息工具进行蛋白质分子设计，并结合定点突变技术提高淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061中性植酸酶的活性，尚未见有关文献报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种突变的中性植酸酶，该突变的中性植酸酶与野生酶相比，在pH6. O 7. 5下活性增加25-35% ο本专利技术的另ー个目的是提供编码上述突变中性植酸酶的基因(核苷酸序列)，该突变的中性植酸酶基因可用于构建重组菌。本专利技术的再ー个目的是提供上述突变中性植酸酶的生产方法。 上述突变中性植酸酶核苷酸序列与野生酶核苷酸序列(GenBank登录号为HM747163)相比，第148位的编码天冬氨酸的密码子突变为编码谷氨酸的密码子。本专利技术的目的可以通过以下措施达到编码权利要求I所述的突变中性植酸酶的核苷酸序列(即对应野生型中性植酸酶氨基酸序列第148位的天冬氨酸密码子突变为表达谷氨酸的密码子)，如SEQ ID NO. I所述。一种突变的中性植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。该序列表示原中性植酸酶氨基酸序列(即野生型淀粉液化芽抱杆菌Bacillus amyIoliquefaciens DSM 1061PhyC基因所表达的氨基酸序列)的148位的天冬氨酸残基被谷氨酸残基所取代。含有上述核苷酸序列的表达载体。如质粒等。用上述表达载体转化的大肠杆菌。用IPTG诱导大肠杆菌表达目的蛋白，表达产物利用Ni-NTA琼脂糖凝胶进行亲和纯化。所述的突变中性植酸酶在饲料生产中的应用。本专利技术的有益效果本专利技术所提供的中性植酸酶与野生酶相比，活性显著提高。本专利技术还提供了该突变中性植酸酶的基因序列，这些序列可用于构建表达高活性中性植酸酶的重组菌。本专利技术还提供了所述的突变中性植酸酶的生产方法。本专利技术涉及的中性植酸酶可以作为一种饲料添加剂，能有效提高动物对饲料中磷元素的利用率。附图说明图I表达重组质粒构建图。图2突变酶表达及纯化结果SDS-PAGE分析。图3不同温度下野生酶及突变酶活性比较。图4不同pH下野生酶及突变酶活性比较。具体实施例方式以下通过实施例对本专利技术做进ー步的阐述，但不限制本专利技术。实施例I :淀粉液化芽抱杆菌 Bacillus amyIoliquefaciens DSM 1061 phyC 基因的获得及第148位氨基酸残基的突变淀粉液化芽抱杆 菌Bacillus amyIoliquefaciens DSM 1061 从德国 DSMZ 购得。培养基的制备蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 10g/L，121 °C，高压蒸汽灭菌15min。菌体的收集将Bacillus amy Io liquefaciens DSM 1061接种到上述培养基中，置37°C摇床，180r · mirT1培养过夜，8000r · min'fC,离心15min，收集菌体。目的基因的提取采用改良的的酚-氯仿抽提法获取Bacillusamyloliquefaciens DSM 1061的基因组，以该基因组为模版，使用如下PCR引物(由生エ生物工程(上海)公司合成)phyC-F:5，-GCGGATCC ATGAATCATTCAAAAACAC-3，(SEQ ID NO. 3)phyC-R:5，-GTC AAGCTT TTATTTTCCGCTTCTGTC-3’ (SEQ ID NO. 4)运用Bio basic INC公司的PCR试剂盒进行PCR反应扩增目的基因。PCR循环參数94°C,3min ；94°C, Imin ；56°本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种突变的中性植酸酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2所示。2.编码权利要求I所示的突变中性植酸酶的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，如SEQ...
【专利技术属性】
技术研发人员：许伟，邵荣，路国伟，余晓红，
申请(专利权)人：盐城工学院，
类型：发明
国别省市：
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