基于抑制的对细胞克隆的高通量筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种用于筛选对靶蛋白具有高水平表达的细胞的方法。所述方法包括向多个宿主细胞引入DNA构建体，所述DNA构建体编码靶蛋白和针对所述宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂；筛选带有该DNA构建体的宿主细胞，用于表达所述内源性可选标记物；和分离出所述可选标记物表达降低的细胞。本发明专利技术还公开了构造为在该宿主细胞中表达该靶蛋白和该抑制剂的DNA构建体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物技术和分子生物学，特别涉及细胞克隆的高通量筛选。
技术介绍
生成产生重组蛋白的细胞系的一个关键步骤是在将感兴趣的基因掺入宿主细胞后存活克隆的选择。为了エ业规模的生物生产，迫切需要稳定地结合了产品基因并产生大量蛋白产物的克隆。在异质种群中，重组基因结合到宿主基因组中是非常随机的事件。含有高拷贝数稳定结合的基因的细胞的比例会小于含有低拷贝数结合基因的细胞。高产的亚克隆稀有并易于被更快生长的非产或低产细胞所稀释。因此，需要筛选并测试许多孔(well)以分离具有増加的生产率的亚克隆。通常，有限的稀释方法冗长且耗吋。使用流式细胞术和细胞分选的选择方法的出现显著提高了可被筛选的细胞的数目。可以在短时间内筛选数百万细胞，并且可以从混合细胞群中分离亚群和单个细胞，即使其在该群中的频度低至10_6。流式细胞术与非荧光报告蛋白配合，用于对产生高水平靶蛋白的克隆的快速早期识别。己基于细胞表面蛋白表达，通过使用能够实现细胞分离的抗体和与配体结合的荧光染料，使其更加便利。例如，可以将细胞表面蛋白(不是通常地在宿主细胞表达)与作为报告分子(reporter)的革巴蛋白协调表达。在表面表达和产率之间的相关性不存在的情况下，可使用如绿色荧光蛋白(GFP)等报告分子，基于胞内蛋白的水平来分离细胞。GFP已成为重要的报告分子，用于基因表达和基于可诱导的基因产物的选择。在哺乳动物细胞系中，GFP已被用于通过与重组蛋白协调表达和基于荧光強度的选择来选择高产克隆。已经观察到表达不同重组蛋白的几个细胞系的GFP荧光强度和重组蛋白生产之间的关联性。然而，这些可选标记物的表达增加了对细胞中的蛋白表达机器的负担，并减少了靶蛋白的产生。
技术实现思路
本专利技术的ー个方面涉及用于筛选对靶蛋白具有高水平表达的细胞的方法。该方法包括向多个宿主细胞引入DNA构建体，所述DNA构建体编码靶蛋白和针对所述宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂；筛选带有(harboring)该DNA构建体的宿主细胞,用于表达所述内源性可选标记物；和分离出所述可选标记物表达降低的细胞。所述DNA构建体构造为在该宿主细胞内表达该靶蛋白和该抑制剂。在一个实施方式中，所述抑制剂选自由小干扰RNA(SiRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、miRNA与shRNA的杂种、和反义RNA组成的组。在另ー个实施方式中，所述抑制剂为shRNA。在另ー个实施方式中，所述内源性可选标记物为荧光标记物，且所述分离步骤包括用荧光活化细胞分选器(FACS)分选细胞。在另ー个实施方式中，所述DNA构建体进ー步编码ニ氢叶酸还原酶(DHFR)，且所述宿主细胞为DHFR-缺陷细胞。本专利技术的另一方面涉及用于选择转基因表达细胞的高通量筛选方法。该方法包括用负载至少ー种转基因和抑制荧光蛋白表达的干扰RNA的载体转染表达该荧光蛋白的宿主细胞；測定被转染细胞中的荧光强度；和分离其荧光強度低于未转染的细胞的荧光強度的细胞。在一个实施方式中，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。在另ー个实施方式中，所述干扰RNA为基于mir-30的shRNA。在另ー个实施方式中，所述分离步骤包括用FACS分选细胞。在另ー个实施方式中，所述表达荧光蛋白的细胞为DHFR缺陷CHO细胞。在另ー个实施方式中，所述至少ー种转基因通过内部核糖体进入位点(IRES)与编码DHFR的基因连接。本专利技术的另一方面涉及表达载体，该表达载体用于高通量筛选带有该表达载体的细胞。所述表达载体包括第一核苷酸序列，其编码靶蛋白；第二核苷酸序列，其编码用于宿主细胞的外源性可选标记物；第三核苷酸序列，其编码针对宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂，和一种或多种调控元件，其控制第一、第二、和第三核苷酸序列在宿主细胞中的表达。所述第一核苷酸序列通过内部核糖体进入位点(IRES)与第二核苷酸序列连接。在一个实施方式中，所述表达载体进ー步包括一种或多种抗阻抑物兀件。在相关的实施方式中，所述ー种或多种抗阻抑物元件包括部分小鼠抗阻抑物元件40。在另ー个实施方式中，所述抑制剂为干扰RNA。在相关的实施方式中，所述干扰RNA为基于miR-30的shRNA。在另ー个实施方式中，所述内源性可选标记物为荧光蛋白。在相关的实施方式中，所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白。在另ー个实施方式中，所述外源性可选标记物为ニ氢叶酸还原酶。在另ー个实施方式中，所述ー种或多种调控元件包括CMV IE增强子。附图说明图I为表不基于GFP的对转基因闻表达细胞克隆进行筛选的方法的不意图。图2为表达载体pScinoDP-DHFR的图谱。图3为表达载体pScinoDP3_DHFR的图谱。 图4为表达载体pScinoDP3mir-DHFR的图谱。图5为表达载体pScinoDP8mir-DHFR的图谱。图6为表达载体pScinoDP9mir-DHFR的图谱。图7A和图7B为构建表达载体pScinoDP9mir_Herceptin (赫赛汀)-DHFR的示意图。图8为表示here印tin-CH0+eFP/_dhft细胞中GFP表达和抗体表达的组图。图A :herc印tin-CHO+———细胞的FACS直方图。图B-C :以不同荧光强度水平分选的here印tin-CHO+ +—细胞的FACS直方图。图E:从不同荧光群(fluorescentpopulations)分选的细胞的抗体生产的ELISA分析。图9为表示在多轮选择之后herceptin-CH0+(FP/_dh&细胞中GFP表达的示意图。图A =GFP表达后的CHC^dhflr细胞的FACS直方图。图B :G418选择后here印tin-CH0+GFP/_dh&细胞的FACS直方图。图C :第一轮MTX(IOOnM)扩增后的here印tin-CH0+(FP/_dhft细胞的FACS直方图。图D :第二轮MTX(IOOnM)扩增后的here印tin-CHO+———细胞的FACS直方图。图10表示由与PE结合的抗人IgG (Fe)抗体染色的here印tin—CHO+GW—细胞的FACS分析。根据实验设计和左上的图，分泌抗体的细胞(Cells secreting antibodies)为PE阳性和GFP阴性。突光信号通过FACS测定,并用标准补偿协议(standard compensationprotocol)校准。图11表示here印tin-CH0+GFP/_dhft细胞FACS分选步骤的重要特征和ELISA結果。图A Herceptin-CH0+GFP/^dhfr细胞的FACS直方图。水平条和灰色区域表示用于单细胞分析的低荧光和高荧光细胞群。图B :通过ELISA检测到的从低荧光或高荧光群中选择的克隆个体的抗体表达水平。图12表示用DNA构建体编码shRNAGFP和Herc印tin转染的细胞中的GFP表达的FACS分析组图。具体实施例方式本专利技术公开了用于筛选对外源性蛋白具有高水平表达的细胞的方法。在一个实施方式中，所述方法包括以下步骤向多个宿主细胞引入DNA构建体，其编码靶蛋白和针对宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂，其中所述构建体构造成在宿主细胞内部表达靶蛋白和抑制剂；筛选带有DNA构建体的用于表达内源性可选标记物的宿主细胞；和分本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.06.11 US 61/213,459;2010.06.03 US 12/792,9241.用于筛选对靶蛋白具有高水平表达的细胞的方法，其包括 向多个宿主细胞引入DNA构建体，所述DNA构建体编码靶蛋白和针对所述宿主细胞中的内源性可选标记物的抑制剂，其中，所述DNA构建体构造为在所述宿主细胞内表达所述靶蛋白和所述抑制剂； 筛选带有该DNA构建体的宿主细胞，用于表达所述内源性可选标记物，和 分离出所述可选标记物表达降低的细胞。2.如权利要求I所述的方法，其中所述抑制剂选自由小干扰RNA(SiRNA)、小发夹RNA(shRNA)、微 RNA(miRNA)、miRNA 与 shRNA 的杂种、和反义 RNA 组成的组。3.如权利要求I所述的方法，其中所述抑制剂为shRNA。4.如权利要求I所述的方法，其中所述内源性可选标记物为荧光标记物，且其中分离步骤包括用荧光活化细胞分选器(FACS)分选细胞。5.如权利要求I所述的方法，其中所述DNA构建体进ー步编码ニ氢叶酸还原酶(DHFR)，且其中所述宿主细胞为DHFR缺陷细胞。6.用于选择转基因表达细胞的高通量筛选方法，该方法包括 用负载至少ー种转基因和抑制荧光蛋白表达的干扰RNA的载体转染所述细胞； 測定被转染细胞中的荧光强度；和 分离其荧光強度低于未转染的细胞的荧光強度的细胞。7.如权利要求6所述的方法，其中所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白(GFP)。8.如权利要求6所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟广，丁敏珮，
申请(专利权)人：台湾神隆股份有限公司，
类型：发明
国别省市：