选择性裂解的全细胞疫苗制造技术

本发明专利技术提供了免疫原性组合物和制备免疫原性组合物的方法，所制备的免疫原性组合物具有灭活的、全细胞肺炎链球菌的、诱导多重免疫力的部分，所述方法通过以下述方式选择性裂解全细胞细菌制剂来制备所述免疫原性组合物：将主要诱导抗体应答的可溶部分和主要诱导抗体非依赖性应答的细胞部分保留在该免疫原性组合物中。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及分子遗传学、免疫学和细菌学。具体而言，本专利技术的实施方式提供了全细胞免疫原性制剂，该制剂赋予了抗体介导和T淋巴细胞介导相协同的免疫应答。就肺炎双球菌(pneumococci)而言,该全细胞免疫原性制剂诱发了抗体介导和T淋巴细胞介导(包括IL-17A介导的)相协同的针对致死性感染和粘膜肺炎双球菌定殖(colonization)的防护作用。
技术介绍
肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae ;肺炎双球菌)感染是世界范围内发病和死亡的主要原因，并在儿童和老年人中引发重病(包括肺炎、脑膜炎和菌血症)和一些不太严重的感染(如中耳炎)。在发展中国家，每年几乎有一百万儿童死于肺炎双球菌疾病的感染。肺炎链球菌多药耐药菌株的快速出现限制了抗生素的效力并鼓舞了利用疫苗预防肺炎双球菌感染的新一轮兴趣。获批的肺炎双球菌疫苗由血清型特异性的荚膜多糖或荚膜多糖-蛋白缀合物的可注射多价混合物组成，并因此仅对所包含的血清型有效。例如，尽管7价肺炎双球菌缀合物疫苗(PCV7)显著地降低了疫苗型(VT)菌株引起的侵袭性肺炎双球菌疾病的发病率，但是最近的研究显示出非VT血清型逐步取代了 VT血清型，潜在地限制了疫苗的有用性。这使得对如下内容进行了评估是否可通过血清型非依赖性抗原(serotype-independent antigens)的免疫接种来预防肺炎双球菌的定殖。例如,用在整个肺炎链球菌种中广泛保守的某些蛋白进行的粘膜免疫显示出诱发全身性的、粘膜抗体并赋予了针对肺炎双球菌疾病和定殖的防护作用。继续对免疫原性组合物(包含肺炎链球菌多糖和蛋白)的鉴定进行研究，所述组合物针对所有血清型均引起抗体介导的免疫应答和T淋巴细胞介导的强免疫应答这两种免疫应答。可选策略使用了灭活的肺炎双球菌细胞(提呈多种血清型非依赖性的抗原)作为廉价疫苗，但是此前未对这些组合物的免疫原性进行足够的探究。因此，对制备全细胞肺炎双球菌疫苗的新策略和了解相关免疫机理存在需要
技术实现思路
本文中给出的实施方式提供了包括革兰氏阳性细菌(例如肺炎双球菌)细胞制剂的免疫原性组合物，所述制剂已通过具有如下特点的方法灭活增加了经传统方法灭活的制剂中未发现的免疫原性组分的暴露，并且保留了细菌尺寸颗粒的优点用于抗原摄取。所述免疫原性组合物包括灭活的、全细胞制剂的细胞部分(cellular fraction)和上清液(例如，溶剂或水相)部分，该组合物与分别给予的细胞部分和可溶部分(soluble fraction)相t匕，显示出协同的免疫原性性质。这些免疫原性组合物并不依赖于肺炎双球菌的荚膜多糖，提供荚膜血清型非依赖性的免疫原性在某些实施方式中，所述肺炎双球菌为无荚膜的变体。在某些实施方式中，所述肺炎双球菌为缺乏IytA基因(指定(specifies)主要的自溶素)的变体，因此，这一肺炎双球菌变体的培养物可生长到相对高的密度而不自溶。在其它实施方式中，已对肺炎链球菌溶血素(PdT，细胞毒素)的基因进行了取代以指定突变的蛋白PdT，所述突变蛋白PdT无毒，但仍然是TLR4激动剂(具有引发(engage)固有免疫系统的能力)。在本专利技术的一个实施方式中，用试剂(如￠-丙内酯(BPL))对肺炎双球菌细胞进行处理(灭活)(a)该试剂以释放出多种保护性免疫原的方式使细胞部分裂解，所述免疫原经验证为可溶分子；(b)该试剂可被除去而不用对收集的细胞进行漂洗，从而使释放入悬浮液中的免疫原可容易地被保留在制剂中；以及(C)该试剂维持了肺炎双球菌细胞的整体结构，以促进通过对具有TLR配体的细菌尺寸颗粒进行应答的免疫系统的传入支(afferent limb)的那些组件进行的摄取。在类似的实施方式中，所述试剂为氯仿或三氯乙烯。在另一实施方式中，通过包括声波处理的方法来制备所述全细胞免疫原性组合物制剂。可通过注射、也可通过鼻腔途径、舌下途径、颊(buccal)途径或透皮途径给予本专利技术的免疫原性组合物。所述免疫原性组合物可与适当的佐剂(如铝佐剂(alum)或肠毒素相关分子(例如霍乱毒素))联合使用。本文所述的肺炎双球菌免疫原性组合物制造起来相对简单且廉价，并且比之前所述的肺炎双球菌疫苗更加有效。例如，少至I. g的剂量显著地使小鼠免于致死实验性肺炎。附图说明图IA显示出在所示剂量时(X轴)，与经乙醇处理的细胞制备的肺炎双球菌全细胞(WC)疫苗(WCE)相比，使用氯仿处理的细胞制备的肺炎双球菌全细胞(WC)疫苗(WCC)增强的保护作用。每隔一周，将疫苗以所示剂量经鼻内给予小鼠，共给予两次，所述疫苗使用Iug的霍乱毒素(CT)作为佐剂。在最后一次免疫接种3周后，用不同的血清型(血清型6B)经鼻内对小鼠进行激发(challenged)。在激发I周后，对每鼻腔洗涤物的菌落形成单位(CFU)进行测定。在比WCE的剂量低10-100倍时，WCC具有显著的保护作用。图IB显示出在IO8剂量时WCB (使用3 -丙内酯制备的WC疫苗)的保护作用(图6A和图6B显示出其在单独的测试中具有与WCC等同的效力)。图IC给出了 WCE、WCC以及WCC离心后的上清液部分(WCCsu)的比较；剂量为IO8的WCE或IO8的WCC或等价量的WCC上清液。所示的组接受CT (霍乱毒素)作为佐剂；一个对照组接受盐水而不是CT ；WCCsu的保护作用大于WCE，具有统计显著性。图ID显示出裂解物具有同等的保护作用，图IE显示出通过血细胞检测的，该裂解物同等地在体外致敏了 IL-17A的应答，IL-17A为定殖模型中的保护作用的相关物(correlate)。图2A-图2B显示出激发前免疫应答与定殖和吸入性脓毒病模型中的保护作用的关系。将剂量为Iy g、10yg或IOOiIg的WCB(使用￠-丙内酯制备的WCV)吸附至Al (OH) 3 (0. 2Img Al/剂)，并每隔两周经皮下注射一次，共注射三次。图2A显示出血清型6B的定殖与IL-17A应答的关系；定殖与IL-17A的激发前浓度呈反相关。图2B显示出吸入性脓毒病模型中的存活率与抗WCA (全细胞抗原)IgG的激发前滴度范围的关系。在第三次给药8天后，将小鼠用异氟醚麻醉并经鼻内(i. n.)给予处于100 u L PBS中的IO6CFU的血清型3菌株WU2。这一模型一般在激发后的I周内在大多数(> 90%)首次接受试验的小鼠(naivemice)体内诱发脓毒病。存活率随滴度升高而增高，并且在滴度> 10，000任意单位(arbitrary units)时，存活率为 100%。图3A和图3B显示出由肺炎双球菌细胞(具体地，RM200细胞)释放的蛋白的 SDS-PAGE的放射显影照片。图3A显示出经氯仿灭活的细胞悬液离心(16，OOOXg ；5min)后的上清液(su) (WCCsu)或经另一有机溶剂三氯乙烯灭活的细胞悬液离心(16，OOOXg;5min)后的上清液(WCTsu);这两种制剂在灭活后均未漂洗。将其与用乙醇灭活的疫苗悬液的上清液(WCEsu)进行比较，该疫苗在传统疫苗制备过程中进行了漂洗；仅残余了痕量的上清液蛋白。图3B显示出经P -丙内酯灭活的细胞的上清液(WCBsu)，类似地，该上清液在灭活后未漂洗。图4A和图4B显示出通过W本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.10.09 US 61/250,348;2010.09.07 US 61/380,4291.具有全细胞革兰氏阳性细菌的、诱导多重免疫力的部分的免疫原性组合物，通过以下述方式选择性裂解全细胞细菌制剂来制备所述免疫原性组合物将主要诱导抗体应答的可溶部分和主要诱导抗体非依赖性应答的细胞部分保留在所述组合物中。2.如权利要求I所述的免疫原性组合物，其中，所述细菌无荚膜。3.如权利要求I或2所述的免疫原性组合物，其中，所述细菌为肺炎链球菌。4.如权利要求1-3任一项所述的免疫原性组合物，其中，通过化学试剂完成所述选择性裂解。5.如权利要求4所述的免疫原性组合物，其中，所述化学试剂为氯仿、三氯乙烯或￠-丙内酯。6.如权利要求1-3任一项所述的免疫原性组合物，其中，通过声波处理完成所述选择性裂解。7.包含如权利要求1-6任一项所述的免疫原性组合物的疫苗。8.如权利要求7所述的疫苗，其中，所述疫苗包含佐剂。9.如权利要求7或8所述的疫苗，其中，所述疫苗被配制为用于...

【专利技术属性】
技术研发人员：理查德·马利，波特·安德森，陆英杰，马克·奥尔德森，乔治·A·罗伯逊，让弗朗索瓦斯·卢西恩·迈松纳夫，安德烈亚·马里亚·泰特，瓦尔德里·德奥利韦拉·迪亚斯，维维亚娜·迈蒙里·贡萨尔维斯，
申请(专利权)人：儿童医疗中心有限公司，疫苗解决途径公司，布坦坦基金会，
类型：发明
国别省市：