松弛素野生型和突变体的制备方法及其所制备的松弛素野生型和突变体技术

本发明专利技术公开了一种利用基因工程手段制备重组人松弛素野生型和突变体的方法，包括以下步骤：(1)设计并合成重组人松弛素野生型和突变体的酵母所喜爱的氨基酸密码子基因序列；(2)设计重组野生型和突变体人松弛素前体的氨基酸序列；(3)构建人松弛素野生型和突变体的分泌型重组酵母表达载体；(4)重组野生型和松弛素突变体的分泌表达；本发明专利技术公开了一种利用基因工程手段表达人松弛素野生型和突变体的方法。本发明专利技术通过巴斯德毕赤酵母表达系统，利用经过改造的分泌型表达载体pPICZ，对人松弛素突变体进行了高效表达；本发明专利技术公开的方法具有产量高，简便易行，费用低廉等优点。重组人松弛素野生型和突变体有扩血管作用，可用于心血管疾病，如高血压，心衰的治疗，伤口愈合和分娩时扩张子宫颈的治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域的人类卵巢松弛素，特别涉及一种具有多重用途的松弛素类化合物或者是野生型和突变体的制备方法以及用途。
技术介绍
众所周知，成熟的人类卵巢松弛素是一个大约6000道尔顿的，具有怀孕的荷尔蒙松弛重要作用的肽激素。H2松弛素可促进生殖道分娩过程，包括子宫颈成熟，增厚的子宫内膜，增加怀孕期的血管，以及对胶原合成有影响。人松弛素主要作用于分娩前生殖道重塑，从而促进产程。在怀孕和分娩的过程中，它调节蛋白在靶器官的结缔组织中重组，以获得的器官结构的必要变化。同时它还对包括早产和分娩时宫颈成熟有抑制作用。目前虽然主要是一个怀孕的激素，但是，松弛素也发现了在非怀孕女性以及男性、同时发现它对心血管和其他器官组织有重要功能。例如(I) H2松弛素还与哺乳有关，有松弛乳腺组织的功能；(2)增强人类精子的流动性；(3)鉴于对结缔组织松弛作用，它已被认为可以改善松弛的皮肤弹性；(4)降血压和抗心功能衰竭等。当然，近年来研究发现重组人松弛素对心衰和高血压有很好的治疗作用，特别是它只对升高的血压部分有抑制作用，却不会像其他抗高血压化合物一样可降低正常血压而导致低血压。而人松弛素扩血管的作用机理包括(I)人松弛素可激活人松弛素受体I和2，导致细胞内cAMP水平升高⑵；诱导N0SII/III，作为NO，cGMP的调节剂；(3)上调内皮细胞的内皮素β受体水平；(4)下调与炎症相关的细胞因子的水平，例如TNF_a ,TGF-β。人松弛素属胰岛素样生长因子家族。与胰岛素相同，松弛素由两个肽链A链和B链组成，A链和B链由两个链间二硫键相连，并在A链形成链内二硫键环。人松弛素Hl和H2显示出相当的核苷酸和氨基酸序列同源性，然而，也有一些显著的差异序列，特别是在A和B链的氨基末端区域。松弛素的结构在进化过程中在种间分歧相当明显只有40%至48%的氨基酸序列同源性存在于猪，老鼠，鲨鱼和人类之中。人松弛素(H2)主要由一种松弛素前体而生成。松弛素前体包括25个氨基酸的信号肽，约29-33个氨基酸的B肽链，104-107个氨基酸的C肽链，以及一个24个氨基酸的A肽链。在松弛素的生物合成过程中，信号肽和C肽链被删除形成成熟的松弛素。C肽链的功能现还不完全理解，猜测与B肽链和A肽链正确链折叠之间的二硫键形成相关。生物合成松弛素是最初由胎盘细胞的核糖体合成前松弛素原。前松弛素原是一种线性分子，由的信号肽，一个B链，I个C肽链和一个A链组成。当运到内质网时，信号肽从前松弛素原裂解出来的产生松弛素原。松弛素原在内质网中形成链内和链间二硫键，从而形成一个三维结构。松弛素原经相关激素原转化酶裂解切割C肽链，产生成熟松弛素。 如图I所示为人松弛素前体示意图。人松弛素前体包括24个氨基酸的信号肽，约29-33个氨基酸的B肽链，104-108个氨基酸的C肽链，以及一个24个氨基酸的A肽链。激素原转化酶裂解位点为箭头所示。如图2所示为成熟人松弛素示意图。人松弛素包括约29-33个氨基酸的B肽链，一个24个氨基酸的A肽链及三个二硫键。A链第10和15位半胱氨酸间形成链内二硫键，B链第11位与A链第11位半胱氨酸间形成链间二硫键，B链第23位与A链第24位半胱氨酸间形成链间二硫键。然而，正是因为我们清楚地了解了人松弛素的重要功能作用，其具体到结构组成以及作用机理，因此，我们迫切的需要将这一重大发现通过人类的智慧而转换为对人类自身有益的专利技术。因此，针对目前人松弛素在生物医药领域的零专利技术利用，一种新的可以在提供良好的性能的松弛素类化合物或者是野生型和突变体的制备方法以及用途的专利技术势在必行
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是突破人松弛素在生物医药领域的零专利技术利用，提供一种利用基因工程手段制备重组人松弛素野生型和突变体的方法。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种利用基因工程手段制备重组人松弛素野生型和突变体的方法，其包括以下步骤(I)设计并合成重组人松弛素野生型和突变体的酵母所喜爱的氨基酸密码子基因序列；(2)设计重组野生型和突变体人松弛素前体的氨基酸序列；(3)构建人松弛素野生型和突变体的分泌型重组酵母表达载体；(4)重组野生型和松弛素突变体的分泌表达；即一种细胞松弛素野生型和突变体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤设计并合成重组人松弛素野生型和突变体的酵母所喜爱的氨基酸密码子基因序列；设计重组野生型和突变体人松弛素前体的氨基酸序列；构建人松弛素野生型和突变体的分泌型重组酵母表达载体；重组野生型和松弛素突变体的分泌表达。所述构建人松弛素野生型和突变体的分泌型重组酵母表达载体通过巴斯德毕赤酵母表达系统，并利用经过改造的分泌型表达载体，对人松弛素突变体进行高效表达。所述设计并合成重组人松弛素野生型和突变体的酵母所喜爱的氨基酸密码子基因序列根据酵母所喜爱的氨基酸密码子构成，包括N端组氨酸肽链为纯化用以及内在3个蛋白酶切位点为切除N端组氨酸肽链和C肽链用，24个氨基酸的A肽链，29个氨基酸的B肽链，12个氨基酸的C肽链。且突变体序列中A肽链含5个突变点，B肽链含I个突变点。所述重组人松弛素野生型和突变体表达载体被转化入巴斯德毕赤酵母中进行诱导表达，其过程包括0. 5%甲醇被用于诱导表达，诱导24，48，72和96小时后，分别取培养液上清。一种细胞松弛素突变体的制备方法，还包括如下步骤重组人松弛素野生型和突变体的切割，分离和纯化；重组人松弛素野生型和突变体的结构确定，以及；重组人松弛素野生型和突变体的活性鉴定。所述重组人松弛素野生型和突变体前体用Ni-NTA亲和层析纯化；纯化的重组人松弛素野生型和突变体前体经过蛋白酶切除N端组氨酸肽链和C肽链形成成熟的重组人松弛素野生型和突变体；成熟的重组人松弛素野生型和突变体经凝胶过滤层析分离纯化。所述本专利技术的人松弛素突变体的氨基酸序列中A肽链包括5个突变点，B肽链包括I个突变点，以及，仅含12个氨基酸的C肽链。所述本专利技术的野生型和突变体人松弛素前体氨基酸序列，其包括N端6个组氨酸肽链为纯化用；三个凝血酶原蛋白酶切位点甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分别在N端6个组氨酸肽链与B肽链连接外B，肽链与C肽链连接处，和C肽链与A肽链连接处；含12个氨基酸的C肽链为连接肽链；29个氨基酸的B肽链；以及一个24个氨基酸的A肽链。所述两种松弛素前体均包括三个凝血酶原蛋白酶切位点甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分别在N端6个组氨酸肽链与B肽链连接处B，肽链与C肽链连接处，和C肽链与A肽链连接处。 所述两种松弛素前体经凝血酶原蛋白酶切割形成成熟的野生型和突变体松弛素；切割后，在B链的氨基端将有一个附加的甘氨酸，羧基端将有附加的甘氨酸-精氨酸；在A链的氨基端将有一个附加的甘氨酸。所述本专利技术强调以下任何一种或多种突变的位点B肽链第5位谷氨酸，A肽链第1，2，3，4和23位的谷氨酰胺，亮氨酸，酪氨酸，丝氨酸和脯氨酸。所述本专利技术所描述的突变体松弛素包含以上所示6个位点中任何一个或任何多个位点突变成任何一种氨基酸的所有突变体松弛素的总和。所述B肽链第5位突变为天冬氨酸，A肽链第I，2，3，4和23突变为谷氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，酪氨酸和缬氨酸。所述的松弛素野生型和突变体的制备方法所制备的松弛素野生型和突变体，其所述构建人松弛素野生型和突变体的分泌型重组酵母表本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种松弛素野生型和突变体的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤 设计并合成重组人松弛素野生型和突变体的酵母所喜爱的氨基酸密码子基因序列； 设计重组野生型和突变体人松弛素前体的氨基酸序列； 构建人松弛素野生型和突变体的分泌型重组酵母表达载体； 重组野生型和松弛素突变体的分泌表达。2.如权利要求I所述的松弛素野生型和突变体的制备方法，其特征在于，所述构建人松弛素野生型和突变体的分泌型重组酵母表达载体通过巴斯德毕赤酵母表达系统，并利用经过改造的分泌型表达载体，对人松弛素野生型和突变体进行高效表达。3.如权利要求I所述的松弛素野生型和突变体的制备方法，其特征在于，所述设计并合成重组人松弛素野生型和突变体的酵母所喜爱的氨基酸密码子基因序列根据酵母所喜爱的氨基酸密码子构成，包括N端组氨酸肽链为纯化用以及内在3个蛋白酶切位点为切除N端组氨酸肽链和C肽链用，24个氨基酸的A肽链，29个氨基酸的B肽链，和12个氨基酸的C肽链。且人松弛素突变体序列中含包括5个突变点的A肽链，I个突变点的B肽链。4.如权利要求I所述的松弛素野生型和突变体的制备方法，其特征在于，所述重组人松弛素野生型和突变体表达载体被转化入巴斯德毕赤酵母中进行诱导表达，其过程包括O.5%甲醇被用于诱导表达，诱导24，48，72和96小时后，分别取培养液上清收集表达的重组蛋白。5.如权利要求1-4之一所述的松弛素野生型和突变体的制备方法，其特征在于，还包括如下步骤 重组人松弛素野生型和突变体的切割，分离和纯化； 重组人松弛素野生型和突变体的结构确定，以及； 重组人松弛素野生型和突变体的活性鉴定。6.如权利要求5所述的松弛素野生型和突变体的制备方法，其特征在于，所述重组人松弛素野生型和突变体前体用Ni-NTA亲和层析纯化；纯化的重组人松弛素野生型和突变体前体经过蛋白酶切除N端组氨酸肽链和C肽链形成成熟的重组人松弛素野生型和突变体；成熟的重组人松弛素野生型和突变体经凝胶过滤层析分离纯化。7.如权利要求I所述的松弛素野生型和突变体的制备方法，其特征在于，所述本发明的人松弛素突变体的氨基酸序列中A肽链包括6个突变点，B肽链包括4个突变点，以及，仅含8个氨基酸的C肽链。8.如权利要求I所述的松弛素野生型和突变体的制备方法，其特征在于，所述本发明的野生型人松弛素前体氨基酸序列，其包括N端6个组氨酸肽链为纯化用；三个凝血酶原蛋白酶切位点甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分别在N端6个组氨酸肽链与B肽链连接处，B肽链与C肽链连接处，和C肽链与A肽链连接处；含12个氨基酸的C肽链为连接肽链；29个氨基酸的B肽链；以及一个24个氨基酸的A肽链。9.如权利要求I所述的松弛素野生型和突变体的制备方法，其特征在于，所述两种松弛素前体均包括三个凝血酶原蛋白酶切位点甘氨酸-精氨酸-甘氨酸，分别在N端6个组氨酸肽链与B肽链连接处，B肽链与C肽链连接处，和C肽链与A肽链连接处。10.如权利要求I所述的松弛素野生型和突变体的制备方法，其特征在于，所述两种松弛素前体经凝血酶原蛋白酶切割形成成熟的野生型和突变体松弛素；切割后，在B链的氨基端将有一个附加的甘氨酸，羧基端将有附加的甘氨酸-精氨酸；在A链的氨基端将有一个附加的甘氨酸。11.如权利要求I所述的松弛素突变体的制备方法，其特征在于，所述本发明强调以下任何一种或多种突变的位点=B肽链第5位谷氨酸，A肽链第1，2，3，4和23位的谷氨酰胺，亮氨酸，酪氨酸，丝氨酸和脯氨酸12.如权利要求11所述的松弛素突变体的制备方法，其特征在于，所述本发明所描述的突变体松弛素包含以上所示6个位点中任何一个或任何多个位点突变成任何一种氨基酸的所有突变体松弛素的总和。13.如权利要求11所述的细胞松弛素突变体的制备方法，其特征在于，所述B肽链第5位突变为天冬氨酸，A肽链第I，2，3，4和23突变为谷氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，酪氨酸和缬氨酸。14.如权利要求I所述的松弛素野生型和突变体的制备方法，其特征在于，所述本发明所描述的人重组松弛素野生型和突变体的基因序列。15.如权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：周永刚，谭文斌，
申请(专利权)人：上海佑科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：