一种Rab23的shRNA及其慢病毒载体和应用制造技术

本发明专利技术公开了干扰Rab23基因的siRNA，该siRNA是针对Rab23基因的靶点序列形成的发卡RNA，所述的siRNA为双链siRNA，其中的一条链的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1或SEQ.ID.NO.2所示。Rab23蛋白的表达与皮肤鳞癌的发展正相关，尤其是与鳞癌的侵袭能力相关，干扰Rab23蛋白的表达能够使鳞癌细胞的侵袭能力下降。针对Rab23基因靶点序列的干扰shRNA作为抗皮肤鳞癌药物的制备的应用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于皮肤鳞癌防治
，涉及一种Rab23的shRNA及其慢病毒载体和应用。
技术介绍
Rab23是RAS原癌基因成员，其编码的蛋白是小GTP酶超家族Rab家族成员，其突变可引起小鼠开脑综合征(open brain syndrome),因此又称为opb基因。2001年，Eggenschwiler等研究发现,Rab23是Sonic Hedgehog信号通路必要的负调控因子,而近几年，Rab23作为原癌基因的作用越来越被学者重视。研究发现，Rab23参与肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、和甲状腺癌的发生发展，并在胃癌中首次发现与肿瘤侵袭密切相关。现有技术中，有学者直接将化学合成的SiRNA片段转染哺乳动物细胞能特异性抑制细胞内同源基因的表达，但转染效率低、细胞内siRNA片段很容易被降解，因此这种方法不能实现稳定的RNA干扰。慢病毒载体在哺乳动物体内感染效率高、免疫原性低、且能感染分裂相和非分裂相细胞。由于病毒载体的这些特性，慢病毒介导RNA干扰能在各类哺乳动物细胞长期稳定表shRNA，抑制基因表达，具有高效、稳定、特异性强、适用范围广的特点，已成为RNA干扰技术的主要研究工具。RNA干扰技术在生物医药研究上的应用为临床肿瘤的应用基础研究增加了强有力的手段。
技术实现思路
本专利技术解决的问题在于提供一种Rab23的shRNA及其慢病毒载体和应用，该慢病毒载体的转染能够抑制鳞癌细胞中的Rab23基因的表达，抑制鳞癌细胞的侵袭。本专利技术是通过以下技术方案来实现一种干扰Rab23基因的shRNA，该shRNA是针对Rab23基因的靶点序列形成的短发卡RNA,所述的祀点序列为gcgacaaatt caagttaat。所述的Rab23的shRNA，其中的一条链的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I或SEQ.ID. NO. 2 所示。一种干扰Rab23基因的载体，该载体包含由SEQ. ID. NO. I和SEQ. ID. NO. 2所示的序列构成的双链shRNA。所述的干扰Rab23基因的载体，该载体为GV248_Rab23_shRNA，是在GV248载体中克隆入由SEQ. ID. NO. I和SEQ. ID. NO. 2所示的序列构成的双链shRNA。一种抑制鳞癌细胞的重组慢病毒，是由包装质粒Helper I. O、Helper 2. O表达的蛋白包裹含有GV248-Rab23-shRNA载体的基因组；该慢病毒是将GV248-Rab23-shRNA表达质粒与包装质粒Helper I. O,Helper 2. O混合感染宿主细胞，经培养后裂解而产生。 针对Rab23基因靶点序列的干扰shRNA作为抗皮肤鳞癌药物的制备的应用。所述的祀点序列为gcgacaaattcaagttaat。所述的干扰shRNA为由SEQ. ID. NO. I和SEQ. ID. NO. 2所示的序列构成的短发卡RNA。所述的干扰shRNA包装为慢病毒由包装质粒Helper I. 0> Helper 2. O表达的蛋白包裹含有GV248-Rab23-shRNA载体的基因组。所述的抗皮肤鳞癌药物为抗鳞癌细胞侵袭性的药物。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益的技术效果本专利技术提供的干扰Rab23基因的shRNA及其抗皮肤鳞癌的应用是基于Rab23蛋白的表达与皮肤鳞癌的发展正相关，尤其是与鳞癌的侵袭能力相关，干扰Rab23蛋白的表达能够使鳞癌细胞的侵袭能力下降。所述的相关性表现为使用免疫组织化学的方法检测手术切除后人正常皮肤、皮肤鳞癌的癌前病变光 线性角化病、原位鳞癌和侵袭性鳞癌组织中Rab23的表达差异，结果表明人正常皮肤中不表达Rab23蛋白，光线性角化病组织中Rab23蛋白低表达，原位鳞癌和侵袭性鳞癌组织中Rab23蛋白高表达，侵袭性鳞癌组织中Rab23蛋白表达量明显高于原位鳞癌组织。Rab23蛋白的表达与皮肤鳞癌的发展正相关提示Rab23基因或蛋白能够作为皮肤鳞癌防治的靶点。进一步,本专利技术提供了针对Rab23基因的特异性短发卡RNA (short hairpin RNA,shRNA)，然后构建载有该shRNA的慢病毒载体，使用针对Rab23基因的shRNA的慢病毒载体、辅助质粒Helper I. O和Helper 2. O包装慢病毒并感染鳞癌细胞，导入鳞癌细胞中后，能够有效的抑制鱗癌细胞中的Rab23的表达。而且慢病毒感染后，能够持续抑制的鱗癌稳转细胞，通过Transwell侵袭实验发现鳞癌细胞的侵袭能力明显下降。这表明所构建的慢病毒能够应用于鳞癌细胞的防治，或者抗鳞癌细胞药物的制备。附图说明图I为免疫组织化学的方法检测正常皮肤、皮肤鳞癌的癌前病变光线性角化病、原位鳞癌和侵袭性鳞癌组织中Rab23的表达差异结果图；图2为GV248质粒的质粒图谱示意图；图3 为 Western-blot 检测 GV248_Rab23_shRNA 质粒 RNA 干涉效果结图；图4为Helperl. O质粒的质粒图谱示意图；图5为Helper2. O质粒的质粒图谱示意图；图6-1 图6-2为HSQ-89NC及Rab23_shRNA稳转细胞结果图；图7-1 图7-3为Rab23干扰降低鳞癌细胞侵袭性的结果图。具体实施例方式下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述，所述是对本专利技术的解释而不是限定。I、Rab23蛋白的表达与皮肤鳞癌的相关性正常皮肤、皮肤鳞癌的癌前病变光线性角化病、原位鳞癌和侵袭性鳞癌组织中Rab23的表达差异收集手术切除后正常皮肤组织(Normal) 31例，皮肤鳞癌的癌前病变光线性角化病组织(AK) 31例，原位鳞癌组织(Bowen’s)42例，侵袭性鳞癌组织(SCC)45例。经15%福尔马林固定，行石蜡包埋后切片。石蜡切片经二甲苯及梯度乙醇脱蜡复水后，柠檬酸缓冲液煮沸做抗原修复，10% BSA封闭37°C lh，加入工作浓度为I μ g/ml的小鼠抗人Rab23 —抗，4°C孵育过夜。加入I : 1000稀释后的HRP标记的羊抗小鼠二抗37°C孵育2小时。PBS洗涤后，用DAB溶液显色，室温3-5分钟，自来水冲洗后作苏木精衬染，二甲苯透明化后中性树胶封片。显微镜下观察，根据着色程度判定Rab23表达程度。如图I的免疫组化结果所示，Rab23在正常皮肤中不表达，皮肤鳞癌的癌前病变光线性角化病中低表达，而在原位鳞癌及侵袭性鳞癌中表达明显增加；并且侵袭性鳞癌组织中Rab23蛋白表达量明显高于原位鳞癌组织。Rab23蛋白的表达与皮肤鳞癌的发展正相关提示Rab23基因或蛋白能够作为皮肤鳞癌防治的靶点。进一步分析发现，Rab23的表达与鳞癌细胞的分化程度呈负相关，即鳞癌分化程度越低，Rab23的表达越强。而且，曝光部位的鳞癌组织中Rab23表达也显著增加，这些均提示Rab23表达可能与鳞癌的侵袭性有关。2、Rab23基因的shRNA序列的设计及载体的构建 2. I设计针对人Rab23基因shRNA序列从genebank 中调取 human Rab23 基因序列(NM_016277),根据 Rab23CDS 序列，使用BLOCK-iT RNAiDesigner在线软件设计针对Rab23基因RNAi的有效靶点，筛选的靶点序列为 GCGACAAATTCAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种干扰Rab23基因的shRNA，其特征在于，该shRNA是针对Rab23基因的靶点序列形成的短发卡RNA,所述的祀点序列为gcgacaaatt caagttaat。2.如权利要求I所述的干扰Rab23的shRNA，其特征在于，所述的shRNA为短发卡RNA，其中的一条链的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. I或SEQ. ID. NO. 2所示。3.一种干扰Rab23基因的载体，其特征在于，该载体包含由SEQ. ID. NO. I和SEQ.ID. NO. 2所示的序列构成的shRNA。4.如权利要求3所述的干扰Rab23基因的载体，其特征在于，该载体为GV248-Rab23-shRNA,是在GV248载体中克隆入由SEQ. ID. NO. I和SEQ. ID. NO. 2所示的序列构成的shRNA。5.一种抑制鳞癌细胞的重组慢病毒，其特征在于，是由包装质粒Helperl. O、Helper2. ...

【专利技术属性】
技术研发人员：李承新，简强，唐利，刘博强，薛柯，苗叶，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：