本发明专利技术涉及一种抗RNA类病毒siRNA分子的设计方法,包括:(1)选择RNA病毒内部、序列保守的RNA依赖的RNA聚合酶作为siRNA的靶标;(2)利用siRNA设计软件生成抗RNA病毒的小RNA分子;(3)根据siRNA设计规则,筛选理论上高效的siRNA用于实验研究;(4)小RNA分子的抗病毒应用形式为含RNA聚合酶III启动子U6的表达质粒。运用本方法选择抗病毒靶标序列可显著提高获得高效抗病毒小RNA分子的几率,大幅缩小RNA干扰靶点的选择范围,提高工作效率,显著降低RNA干扰技术研究和应用成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于RNA干扰
,特别涉及。
技术介绍
RNA类病毒种类很多,分布广泛,水生和陆生动物以及人类均有感染。如对水生养殖虾类造成严重威胁的桃拉病毒(TSV)、罗氏沼虾诺达病毒(MrNV)、传染性肌肉坏死病毒(IMNV)和对陆生动物包括人类危害巨大的流感病毒(Flu virus)、人甲型肝炎病毒(HAV)、艾滋病毒(HIV),以及各种冠状病毒如严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)等。由于RNA病毒在RNA的复制过程中,其错误修复机制的酶的活性很低,几乎是没有的,所以其变异很快;而疫苗是要根据病毒的固定基因或蛋白进行开发制作的,所以RNA病毒疫苗较难开发!RNA干扰技术,作为一种以短双链RNA(SiRNA)代替传统反义核酸的转录后基因沉默机制,自2002年被《Science》评为年度10大突破以来,已经被迅速而广泛地应用到了基因功能、基因表达调控机制等热门领域,并为疾病基因治疗、抗病毒感染开辟了新的途径。相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除,整个流程设计更简便,作用更迅速,效果更明显,成为研究人员公认的高效特异、经济便捷的研究工具,在细胞水平和动植物体内均表现出高效特异的抗病毒能力。由于RNA干扰技术是转录后基因沉默机制,直接靶标是病毒转录产生的mRNA,那么对于RNA病毒尤其是正链RNA病毒而言,RNA干扰技术就可直接降解病毒基因,因此RNAi技术对于RNA类病毒的防治而言无疑是一个上佳之选。许多研究结果也证实,RNA干扰技术抗病毒领域取得了预期的成果。但是,由于抗病毒用siRNA仅仅是21个碱基对的短小序列,根据常规的小RNA设计原则,多数病毒基因组将产生成百上千个候选siRNA。尤其是像冠状病毒科成员那样的基因组巨大的RNA病毒,根据常规设计原则将需要花费大量的人力、物力,用来筛选在实际应用中能高效抗病毒的siRNA(由于目标RNA的空间结构等原因,导致许多理论上符合“有效”原则的siRNA在实际应用中无效或低效)。因此,如何有效缩小高效siRNA的筛选范围一直是RNA干扰技术研究人员探究的热点问题,也是关系到能否有效降低RNA干扰技术的研究与应用成本,使其最终能在生产实践中得到推广、应用的关键问题。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供,该方法设计的siRNA分子,将在保证获得高效抗病毒siRNA的前提下,大幅缩小RNA分子筛选范围,显著降低抗病毒研究和应用成本,有利于RNA干扰技术在抗RNA病毒领域的推广和应用。本专利技术中一种抗RNA类病毒siRNA分子的设计方法,包括(I)在RNA病毒的基因组中选择序列保守的病毒酶的编码基因作为siRNA的靶标;(2)利用siRNA设计软件生成抗RNA类病毒的小RNA分子;(3)根据siRNA设计规则,筛选理论上高效的siRNA用于实验研究。所述步骤(I)中的序列保守的RNA病毒酶为RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)。所述步骤(3)中的小RNA分子的抗病毒应用形式为,把小RNA分子构建成含RNA聚合酶III启动子U6的表达质粒。表I是shRNA在TGEV不同结构基因和RdRP基因上的靶向序列。其中,shPl和 shP2靶向TGEV RdRP基因,而shSl、shS2、shM、shNl和shN2分别靶向TGEV的不同结构基因;shT靶向与TGEV基因没有同源性的一段任意序列,用作显示shRNA干扰特异性的对照。表I shRNA靶向序列shPl5--GTACTGGGATCGCACATAT-3 ’ shP2 5'-GGCAAGAGCTCGTACAGTA-3, shS I 5'-CCAGTGGAATCTC ATTGAA-3 ’shS25'-CTAGTTCTGACTTTGTTCA-3J shM 5'-GAAGTTGAAAGCAAGTAGT-3, shNl 5'-CAAGAAGGATGACAGTGTA-3 ’ shN2 5'-GGATGACAGTGTAGAACAA-3, shT5'-GACTTCATAAGGCGCATGC-3,我们通过对RNA病毒一TGEV进行细胞水平的RNA干扰研究发现,在分别靶向病毒RdRP基因和结构蛋白基因的siRNA中,两个靶向RdRP的小RNA表现出远远高于其他siRNA的抗病毒效果。随后在小型猪体内水平进行的抗病毒应用研究,进一步证实了这两个siRNA分子抗病毒的高效性和特异性。有益效果本专利技术把siRNA的作用靶标锁定在RNA依赖的RNA聚合酶,有两个意义(I)RdRP保守程度高,对于容易变异的RNA病毒而言很重要,因为根据Genbank中的序列设计的siRNA,有可能靶向的病毒本身在该处出现了序列变异,而研究表明,即使I个碱基的变化都会导致siRNA的抗病毒效果大幅降低。(2)部分RNA病毒如冠状病毒基因组巨大。以TGEV为例,得到的理论上“有效”的siRNA将大于1000个。如果把这些siRNA全部在细胞水平进行筛选研究,无疑将耗费大量的人力、物力。而根据本专利技术设计的siRNA分子,将在保证获得高效抗病毒siRNA的前提下,大幅缩小RNA分子筛选范围,显著降低抗病毒研究和应用成本,有利于RNA干扰技术在抗RNA病毒领域的推广和应用。附图说明图I是CPE分析不同shRNA表达载体对TGEV的抑制作用。其中,m表示孔中部细胞,s表示孔边缘细胞;normal是阴性对照(未处理的正常细胞);mock是阳性对照(只感染TGEV);图2是MTS法分析不同shRNA表达载体对ST细胞的保护作用。具体实施例方式下面结合具体实施例,进一步阐述本专利技术。应理解,这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解,在阅读了本专利技术讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 实施例I 小RNA分子的设计与合成(I)分别选取TGEV结构蛋白和RdRP的编码基因;(2)利用软件生成抗TGEV的siRNA分子。(3)按照已公布的小RNA序列设计规则,选择理论上高效的siRNA分子,并构建成发卡型小RNA(shRNA)分子(表I)。(4) shRNA分子插入载体构建成含U6启动子的质粒表达载体。实施例2shRNA表达质粒转染ST细胞(I) ST细胞(2-3 X IO4个/孔)接入48孔板于完全DMEM中培养;(2)向转染试剂 TransFast transfection reagent 中加入 400 μ I 无 DNase 水,漩涡震荡溶解,_20°C保存;(3)溶解质粒DNA1. 2 μ g溶于300 μ I无血清无双抗培养基中;(4)室温溶化转染试剂并涡旋,取3. 6 μ I加入DNA/DMEM混合物中,涡旋混匀;室温孵育10-15分钟,形成转染复合物;(5)移去ST细胞中的培养基,加入转染复合物100 μ I/孔,继续于37°C 5% CO2培养箱中孵育I小时;向ST细胞中加入400 μ I无双抗完全培养基(含5% NBS);在37°C,5% CO2的培养箱中继续培养。实施例3TGEV感染ST细胞shRNA表达质粒转染ST细胞28h后移去细胞培养基,按200CCID5(I的量接种TGEV。4本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种抗RNA病毒SiRNA分子的设计方法,包括 (1)在RNA病毒的基因组中选择序列保守的病毒酶的编码基因作为siRNA的靶标; (2)利用siRNA设计软件生成抗RNA病毒的小RNA分子; (3)根据siRNA设计规则,筛选理论上高效的siRNA用于实验研究。2.根据权利要求I所述的一种...
【专利技术属性】
技术研发人员:周俊芳,华修国,崔立,房文红,
申请(专利权)人:中国水产科学研究院东海水产研究所,
类型:发明
国别省市:
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