本发明专利技术公开了一种抑制人microRNA-299-5p表达的反义寡聚核苷酸及其应用。该反义寡聚核苷酸特异性结合于人miR-299-5p，包含与下述核苷酸序列中13～22个连续核苷酸互补的序列：5’-UGGUUUACCGUCCCACAUACAU-3’，特别是其包含序列：5’-AUGUAUGUGGGACGGUAAACCA-3’。本发明专利技术的反义寡聚核苷酸可以为核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体，并可对链中任一核苷酸进行修饰。本发明专利技术的miR-299-5p反义寡聚核苷酸能够有效抑制人脑胶质瘤细胞中miR-299-5p表达，抑制其生长和增殖，从而有效治疗脑胶质瘤及其他miR-299-5p高表达的肿瘤。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医学材料
和药物领域。具体地，本专利技术涉及一种microRNAs (miRNA)反义寡聚核苷酸，尤其是涉及人microRNA-299_5p (人miR-299_5p)反义寡聚核苷酸及其应用。该反义核酸可与人miR-299-5p互补，从而抑制人miR-299-5p的表达而起到抗肿瘤的作用。本专利技术还涉及包含该miRNA反义寡聚核苷酸的药物组合物。
技术介绍
miRNAs (又称为microRNA或微小RNA)是小的非编码RNA，长度为20_25bp，通常是由RNA聚合酶II (Pol II)转录的，一般最初产物为大的具有帽子结构(7MGpppG)和多聚腺苷酸尾巴(MAAA)的pri-miRNA(primary miRNA,初级miRNA)。这些pri-miRNA在RNase IIIDrosha和其辅助因子Pasha的作用下被处理成70个核苷酸组成的前体miRNA (precursor miRNA, pre-mi RNA)。RAN-GTP和export in 5 (输出蛋白5)将这种前体分子输送到细胞质中。随后，另一个RNase III Dicer(核糖核酸内切酶)将其剪切产生约为22个核苷酸长度的双链。这种双链很快被引导进入miRISC(miRNA-induced silencing complex, miRNA诱导的沉默复合物)复合体中，其中含有Argonaute蛋白(AGO蛋白)，并且成熟的单链miRNA保留在这一复合物中。成熟的miRNA结合到与其互补的mRNA的位点通过两种依赖于序列互补性的机制负调控基因表达，与靶mRNA不完全互补的miRNA在蛋白质翻译水平上抑制其表达。然而，最近也有证据表明，这些miRNA也有可能影响mRNA的稳定性。使用这种机制的miRNA结合位点通常在mRNA的3’端非翻译区。如果miRNA与靶位点完全互补(或者几乎完全互补)，那么这些miRNA的结合往往引起祀分子mRNA的降解。miRNAs在物种进化中相当保守，在动物，植物和真菌等中发现的miRNAs表达均有严格的组织特异性和时序性。目前，只有很小一部分miRNAs的生物学功能得到阐明。这些miRNAs调节细胞生长和组织分化，与生物生长发育有关。一系列的研究表明miRNAs在细胞生长和凋亡、血细胞分化、同源异形盒基因调节、神经元的极性、胰岛素分泌、大脑形态形成、心脏发生和胚胎后期发育等过程中发挥重要作用。例如，miR-273参与线虫的神经系统发育过程;miR-430参与斑马鱼的大脑发育；miR-181控制哺乳动物造血细胞分化为B细胞；miR-375调节哺乳动物胰岛细胞发育和胰岛素分泌；miR-143在脂肪细胞分化起作用；miR-196参与了哺乳动物四肢形成，miR-1与心脏发育有关。另有研究人员发现许多神经系统的miRNAs在大脑皮层培养中受到时序调节，表明其可能控制着区域化的mRNA翻译。miRNA表达与多种癌症相关，并且这些基因可能起到肿瘤抑制基因或是癌基因作用。最先在B细胞慢性淋巴性白血病(CLL)中发现有miRNA表达水平的改变，随后陆续在各种人类肿瘤中均检测到miRNA表达水平的变化。研究发现，miRNAs与肿瘤形成相关，既能发挥肿瘤抑制基因的作用(如miR-15a和miR-16-l)，又能起到癌基因的作用(如miR-155和miR-17-92簇)。目前认为，在肿瘤细胞中，有些miRNA成熟体或前体表达水平异常，而表达异常的miRNA通过影响靶mRNA翻译发挥作用，参与肿瘤形成过程，并起重要作用。如Ras原癌基因受let-7家族的调控，BCL2抗凋亡基因受miR-15a-miR-16_l簇调控，E2F1转录因子受miR-17-92簇调控，BCL6抗凋亡基因受miR-127的调控等。miRNAs的表达下调也和肿瘤发生有密切关系，这预示着miRNA具有癌基因的功能。例如，miR-143和miR-145在结肠癌中明显下调。有趣的是，其发夹结构的前体分子在肿瘤和正常组织中含量相似，这表明,miRNAs的表达下调可能是由于其加工过程受到破坏。但是,miR-143和miR-145的肿瘤抑制基因功能可能不仅仅局限于结肠癌，在乳腺癌、前列腺癌、子宫癌、淋巴癌等细胞系中其表达量也明显下调。另一个报道表明，miR-21在胶质母细胞瘤中表达增加。这个基因在肿瘤组织中的表达量比在正常组织中高5-100倍。miRNAs是天然的反义作用因子，能够调控与真核生物生存和增殖相关的多种基因。在肿瘤治疗方面，miRNA的应用前景光明。在利用miRNA作为治疗靶点方面，已有实验数据支持如在吉西他滨( gemcitabine)治疗的过程中，出现miRNA表达谱的变化；调控部分miRNA的表达水平(如使miR-21过表达)，能增进胆管癌细胞对化疗药物的敏感性。通过引入与具有癌基因特性的miRNA互补的合成的反义寡聚核苷酸一抗miRNA寡聚核苷酸(AMOs)一可能有效的灭活肿瘤中的miRNAs,延缓其生长。临床上,可以通过经常的或者持续的2’ -O-甲基化或者锁核酸(LNA)等修饰的反义寡聚核苷酸给药使miRNA失活。这些修饰使得寡核苷酸更稳定，比其他治疗手段毒性更低。使用antagomirs (与胆固醇偶联的AMOs)，注射小鼠后可以在不同器官有效抑制miRNA活性，因而可能成为一种有希望的治疗药物。相反的，过表达那些具有肿瘤抑制基因作用的miRNAs，如let-7家族，也可以用于治疗某些特定的肿瘤。反义寡聚核苷酸(FlanaganWM. Antisense comes of age. Cancer & MetastasisReviews 1998 ;17 (2) :169-76)是指一段可以与其靶基因的碱基互补的核苷酸。反义寡聚核苷酸可以抑制相应基因的表达。人microRNA-299 (hsaiiR-299)位于 14 号染色体，前体序列为 AAGAAAUGGUUUACCGUCCCACAUACAUUUUGAAUAUGUAUGUGGGAUGGUAAACCGCUUCUU(SEQ ID No. I)。 有 2 个成熟 microRNA hsa-miR-299-5p (MIMAT0002890,序列为 UGGUUUACCGUCCCACAUACAU (SEQID No. 2))和 hsa-miR-299-3p(MIMAT0000687，序列为 UAUGUGGGAUGGUAAACCGCUU (SEQ IDNo. 3))。Shevde 等发现在乳腺癌细胞株(MCF7，MCF10AT and MCFI O)中 hsa-mir-299_5p 表达下调，其祀基因osteopontin (OPN)表达上调(Shevde等,2010)。Lowery等发现在乳腺癌中miR-299与雌激素(oestrogen)反应密切相关(Lowery等,2009)。Padgett等利用Quantitative PCR技术发现原发性胆汁性肝硬化中miR-299_5p表达升高(Padgett等,2009)。Guled等利用芯片技术发现恶性间皮瘤患者中吸烟和非吸烟两者中 miR_299_3p 表达不一样(Guled 等,2009)。Chim 等利用 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种人microRNA-299-5p的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸包含与下述核苷酸序列中13 22个连续的核苷酸互补的序列5， -UG⑶UUACC⑶CCCACAUACAU-3，。2.如权利要求I所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸序列为5，-A腳AU⑶GGGACG⑶AAACCA-3，。3.如权利要求I所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸为核糖核 苷酸、脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的嵌合体。4.如权利要求I 3中任一项所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述反义寡聚核苷酸进一步被修饰。5.如权利要求4所述的反义寡聚核苷酸，其特征在于，所述修饰选自核糖修饰、碱基修饰和...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁侃，张佩琢，李捷，沈孝坤，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，苏州吉玛基因药物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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