一种用于免疫细胞治疗的活化单个核细胞的制备方法本发明专利技术提供一种分离、增殖并活化单个核细胞的方法。通过使用含有替曲托肽(Tetratutide，曾用名：T肽)、白介素-2(IL-2)和抗-CD3抗体的培养基培养分离得到的人外周血淋巴细胞，大量制备具有细胞溶解活性的外周血单个核细胞。本发明专利技术的淋巴细胞可显示出明显较高的抗癌作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及制备用作细胞免疫治疗剂的活化单个核细胞的方法，通过从人体外周血液中分离得到单个核细胞，在体外大量培养增殖并活化的单个核细胞，将该活化单个核细胞施予单个核细胞来源的人体；或通过冻存该活化单个核细胞，在需要的时候解冻该冻存的活化单个核细胞并施予单个核细胞来源的人体。达到增强免疫力，治疗癌症、感染性等疾病的作用
技术介绍
机体内具有杀伤作用的淋巴细胞有自然杀伤细胞、杀伤细胞杀伤性T细胞等。它们能识别并清除某些细胞，如癌细胞或感染病毒的细胞。因此，利用那些细胞的功能可以预防和治疗这些疾病。然而根据实验观察，清除ー个肿瘤细胞需要上百个淋巴细胞。而ー立方厘米大小的瘤块中约有10亿个瘤细胞。因此，过继免疫需用大量的淋巴细胞才能收效。早期过继疗法的淋巴细胞取自经肿瘤免疫的个体。但要从一个患过肿瘤的人身上得到如此大量的淋巴细胞是很不现实的。为此，如果将患者免疫细胞在体外大量増殖和激活，然后再回输该自体患者，有可能获得期望较高的抗癌效果。活化单个核细胞是ー种细胞免疫治疗产品，通过在体外大量増殖和激活从人外周血中分离的单个核细胞，并将其回输该自体患者，用于治疗癌症。二十世纪八十年代以来,开展了大量的免疫疗法临床试验，从Rosenberg等人的研究[Rosenberg et al. , N Engl. J. Med. 313, pp. 1485-1492,1985]以来，杀伤细胞在肿瘤的过继疗法中被广泛应用。到目前为止，先后出现了五种引人注目的免疫效应细胞淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK细胞)、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL细胞)(Itoh K，et al. J Exp.Med. 168 :1419-1441，1988)、抗-0)3抗体和白细胞介素-2(1レ2)诱导的杀伤细胞(AK-T细胞)(Uberti JP, et al-Clin. Immunol. Immunother, 70 :234-240,1994)、细胞毒 T 淋巴细胞(CTL) (Aruga A，et al-Int. J. Cancer，49 :19-24，1991)和细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK细胞)(Schmidt-woIf IGH, et al. J. Exp. Med. 174 :139—149，1991)。其中 LAK 细胞、TIL 细胞和CTL细胞因为技术等多方面原因未能广泛应用。目前现有技术己尝试在不同方面发展了CIK技木。本专利技术在现有基础上引入替曲托肽提升杀伤细胞活性。替曲托肽是ー种人工合成的功能性4分支多肽产物。该短肽具有能迅速特异性地与巨噬细胞、单核细胞的结合，増加其活性和与T淋巴细胞的接触，从而提高巨噬细胞对外来入侵者或自身变异细胞的杀伤作用，提高自然杀伤细胞(NK细胞)的活性，促进T淋巴细胞的细胞毒作用，使机体T淋巴细胞和其它免疫细胞增强识别和杀伤外来入侵病原体或自身变异的细胞(如肿瘤细胞)的能力。因此该短肽在临床上具有重要的抗感染和抗肿瘤的应用价值。
技术实现思路
本专利技术主要在于提供制备活化单个核细胞的方法，其中在抗CD-3抗体、IL-2和替曲托肽存在下，通过从人体外周血中分离培养单个核细胞，可以大量制备对肿瘤细胞和感染病毒的细胞具有很强杀伤カ的CIK细胞。本专利技术的另ー个特点在于提供一种细胞免疫治疗组合物，该组合物包含根据所述方法増殖的活化单个核细胞作为活性成分。本专利技术的基本步骤如下一、外周血单个核细胞(PBMC)的制备取人抗凝外周血20 50ml用Hank’ s平衡液稀释一倍后，用 Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich)离心分离 PBMC。离心条件为转速 2000rpm, 25-30 分钟。然后用Hank’s平衡液洗涤PBMC 2次，再进行显微镜下细胞计数，用淋巴细胞培养液AIM-V调节细胞密度成3 5X 106/ml的细胞悬液。ニ、单个核细胞的诱导和扩增将上述PBMC悬液置于培养瓶中，并添加IL-2、抗⑶_3抗体和替曲托肽，终浓度分别为 100-2000u/ml，10_200ng/ml，l_2000ng/ml。置于 37°C，5% CO2 饱和湿度培养箱中培养12-16天。每间隔3-4天更换新鲜AIM-V培养基，同时添加IL-2、抗⑶-3抗体和替曲托肽。三、活化单个核细胞的收获离心收集増殖并活化后的单个核细胞，离心条件为lOOOrpm，5-10分钟。用生理盐水重悬该单个核细胞至终浓度O. 5-1 XlOVmlο此产物可用于人体回输。四、活化单核细胞的冻存与复苏使用细胞冻存液重悬步骤三中的活化单个核细胞。单个核细胞的密度控制在O.5 10. OX IO7细胞/毫升。在该步骤中可使用商业途径获得的冻存液或在合适的缓冲溶液或培养基中含有血清、高分子物质如蛋白质或多糖，和ニ甲亚砜(以下称作“DMS0”)。细胞容器可以是冷冻管或冷冻袋。冻存的温度为液氮的温度_196°C，将细胞以一定的冷却速度冻存，最终保存于液氮中。复苏一般采用快融方法，即从液氮中取出冻存管后，立即放入37°C水浴中，使之在一分钟内迅速融解。然后将细胞转入培养器皿中进行培养。24小时后更换新鲜培养基。本专利技术提供了活化单个核细胞在临床肿瘤综合治疗中的应用方法，适时施用本专利技术活化单个核细胞作为辅助手段在肿瘤综合治疗中的联合应用。所述活化单个核细胞组合物施用的方式为在手臂或者下肢采用8号针头输血器进行静脉滴注。所述单个核细胞组合物优选包含O. 5-1 X IOVml的本专利技术活化单个核细胞，其有效量为80ml-100ml个体的生理盐水组合物。此组合物是一次静脉滴注的剂量，一个疗程三次静脉滴注治疗，从第一次开始期间每间隔三到四天再回输下一次。ー个疗程结束后，可以间隔两到三个月后继续给药，可以实施多疗程回输治疗；如有必要，间隔时间为六个月或一年还可继续再治疗。具体实施例方式參考以下实施例，对本专利技术作进ー步详细描述。这些实施例g在说明本专利技术，并非分别限制本专利技术的范围。实施例I :血液采集和单个核细胞的分离无菌状态下从人体静脉采集20 50ml外周血于含抗凝血剂如肝素或EDTA的血液采集管或袋。在无菌条件下将血液注入50ml离心管中，用Hank’s平衡液稀释一倍。在另一支50ml离心管中加入10-20mlHistopaque-1077溶液(Sigma)。然后，将稀释的血液缓慢加入到离心管中，使液面不分散。稀释的血液与Histopaque-1077溶液体积比为2-4 I。然后将混合物于室温、转速400g条件下离心分离，分离得到单个核细胞组分。然后将该组分用适量的Hank’ s平衡液洗涤3次。用淋巴细胞培养液AIM-V重悬细胞。实施例2.活化淋巴细胞的培养 将单个核细胞悬浮液加入至5mlAM_V培养基(GIBGO，USA)中混合均匀，培养基预先添加IL-2、抗CD-3抗体和替曲托肽，其最终浓度分别为100-2000u/ml，10_200ng/ml，l-2000ng/ml。然后，在37°C和5% CO2条件下，于75cm2细胞培养瓶中进行培养。培养3-4天后，将细胞悬液转移至225cm2细胞培养瓶中进行培养，避免细胞过于拥挤。所使用的AIM-V培养基中IL-2、抗CD-3抗体和替曲托肽终浓度分别为500u/ml，50ng/ml，100ng/ml。在此后本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于免疫细胞治疗的活化单个核细胞的制备方法，包括以下步骤 从人外周血中采集和分离单个核细胞； 使用含有替曲托肽(Tetratut ide)、白细胞介素-2和抗CD-3抗体的培养基体外培养，増殖并活化分离得到的单个核细胞； 活化后的单个核细胞冻存； 解冻和复苏冻存步骤的单个核细胞。2.用于培养并活化单个核细胞的培养基组合物，该组合物包括抗-CD...
【专利技术属性】
技术研发人员：王福生，许亮，韩苏，范业梅，田德青，
申请(专利权)人：元森泰生物科技天津有限公司，
类型：发明
国别省市：
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