本发明专利技术涉及一种泥蚶血红蛋白Tg-HbIIA，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO：1，核苷酸的序列为SEQ?ID?NO：2。本发明专利技术的泥蚶血红蛋白Tg-HbIIA用于制备免疫增强剂。本发明专利技术表达的泥蚶血红蛋白基因HbIIA融合蛋白具有广谱的杀菌活力，特别是对水产动物致病菌弧菌类有较强的杀菌效果，这为研制新型的具有抗微生物活性的药物和在水产养殖业上作为替代抗菌素的新型病害预防治疗制剂奠定了基础。与传统从天然资源提取血红蛋白的方法相比。本发明专利技术的制备方法血红蛋白大批量、无毒性，使低成本的规模化生产成为可能，为海洋养殖贝类饲料添加剂和细菌性疾病疫苗的研制提供了一种新的途径。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于血红蛋白及体外重组表达
，具体涉及ー种泥蚶血红蛋白(Tg-HbIIA)及其应用。
技术介绍
血红蛋白(hemoglobin, Hb)是所有脊椎动物和部分无脊椎动物血液中所含有的一大类含铁的呼吸蛋白，具有多重生物学功能，是最具有研究价值的蛋白质家族之一。 在无脊椎动物中具有血红蛋白的比较少见，ー个有趣的现象是以泥蚶为代表的蚶科贝类的血液中存在大量的血红蛋白，而绝大多数贝类的携氧蛋白是血蓝蛋白，如鲍类、蛤类等(Lieb, et al, Proc Natl Acad Sci USA, 2001，98:4546-4551)。早有研究者提出血蓝蛋白比较原始，在演化过程中逐渐被血红蛋白取代(Mangum, et al, Biol Bull, 1987，173:205-221.)。研究表明贝类血蓝蛋白和脊椎动物血红蛋白不但具有携氧的主要功能，而且还具有抗菌、抗病毒等免疫功能(Jiang, et al, Nat Immunol. 2007, 8:1114-1122·)。研究发现泥蚶血红蛋白在受到弧菌、LPS和PGN等致病因子刺激后，表达量会急剧上升，表明泥蚶血红蛋白基因參与了抗菌免疫反应。随着重组DNA技术和其他现代生物技术的发展，不断有新的功能基因被发现、克隆和表达，人们开创了用基因重组技术体外生产蛋白质的新纪元。在已有的重组蛋白表达体系中，大肠杆菌原核表达系统因其操作方便、价格低廉、高效表达和稳定性等优点成为重组蛋白质的首选表达系统。血红蛋白体外表达的研究仅限于人、猪等大动物，在人血红蛋白体外表达的研究中，已经通过大肠杆菌、真菌实现了体外表达，显示在真菌中表达量不如大肠杆菌高。关于无脊椎动物血红蛋白的体外表达还未见报道，由于无脊椎动物与脊椎动物血红蛋白氨基酸序列及蛋白结构方面的差异，因此，构建合适的表达载体，寻找简便、高效的表达方法是贝类血红蛋白表达现在面临的问题。表达人血红蛋白的目的是寻找天然血液的替代品，从而解决用血紧张的局面，而在贝类等水产动物的研究中，我们的目的是筛选大量表达且具有活性的抗菌血红蛋白工程菌株，继而生产大量高效、低毒、无污染的抗菌蛋白产品，作为饲料免疫添加剂或生产免疫蛋白制剂用于贝类育苗和健康养殖。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种来自于泥蚶的血红蛋白(Tg-HbIIA)，并可将克隆的泥蚶血红蛋白基因通过大肠杆菌体外表达，以弥补现有技术的不足。本专利技术提供ー种泥蚶血红蛋白Tg-HbIIA，其氨基酸序列为SEQ ID NO 1 ；本专利技术还提供一种核苷酸，用于编码上述的血红蛋白(Tg-HbIIA)，所述的核苷酸的序列为SEQ ID NO 2o本专利技术还提供用于表达上述的血红蛋白(Tg-HbIIA)的重组质粒。本专利技术的泥蚶血红蛋白Tg-HbIIA用于制备免疫增强剂，例如作为饲料添加剂和细菌性疾病疫苗。本专利技术表达的泥蚶血红蛋白基因HbIIA融合蛋白具有广谱的杀菌活力，特别是对水产动物致病菌弧菌类有较强的杀菌效果，这为研制新型的具有抗微生物活性的药物和在水产养殖业上作为替代抗菌素的新型病害预防治疗制剂奠定了基础。与传统从天然资源提取血红蛋白的方法相比。本专利技术的制备方法血红蛋白大批量、无毒性，使低成本的规模化生产成为可能，为海洋养殖贝类饲料添加剂和细菌性疾病疫苗的研制提供了一种新的途径。附图说明图I :本专利技术的泥蚶血红蛋白Tg-HbIIA的电泳图， 其中1泳道纯化的重组Tg-HbIIA的SDS-PAGE电泳图，2 泳道用 His 抗体鉴定 Tg-HbIIA 的 Western Blotting 结果图。具体实施例方式I.泥蚶血细胞RNA的提取和反转取鲜活的泥蚶，用针管抽取泥蚶血窦中的血液，取Iml血液放入离心管中，3500转/秒离心一分钟，去上清，保留血细胞，用Trizol试剂抽提RNA。用紫外分光光度计检测A280、A260的相对吸收值，同时采用电泳检查RNA完整性。用M-MLV反转录酶试剂盒反转RNA，得到cDNA第一条链。2.泥蚶血红蛋白基因(Tg-Hb)含ORF的cDNA的亚克隆和验证依据Tg-Hb基因成熟肽cDNA序列设计弓丨物HbIIA-ORF-Fl 5’ GCAAACGAGAAGAACTAAAGCAAC 3’HbIIA-ORF-Rl 5’ CCATTGATGGTTGGTCCAGATA 3’以获得编码该基因成熟肽的基因片段。PCR反应程序94° C变性4 min, I个循环；94° C 变性 50 S，55° C 退火 50s，72。C 延伸 I min，35 个循环；72° C 延伸 10 min,I个循环；4° C保温。，把扩增出的片度连入pGEM-T vector (Promega, USA),并测序获得本专利技术筛选到的泥蚶血红蛋白Tg-HbIIA的核苷酸序列SEQ ID NO :2，翻译出的氨基酸序列为 SEQ ID NO lo3.泥蚶血红蛋白(Tg-Hb)重组质粒构建本专利技术中采用的重组载体为Novagen公司的ρΕΤ原核表达系统载体pET_30b，也可以选用其它的原核表达载体，该载体能够使目标序列与硫氧还蛋白(Trx-Tag)融合，通常能够增加重组蛋白中可溶性蛋白比例。重组子构建步骤如下I)使用5’末端和3’末端分别添加了 XhoI和Hind III特定酶切位点的基因特异性引物 Tg-Hb-EF (5， CTAAGCTTATGGTTGATGCAGCAG 3，)和 Tg-Hb-ER(5，ATCTCGAGCAAGGCAGCTTGGAC 3’)扩增目的基因。2)将扩增片段纯化回收，与pGEM-T载体连接，构建亚克隆。3)转化ToplO感受态细胞后筛选阳性克隆，提取质粒。4)使用限制性内切酶酶切亚克隆质粒，对酶切产生的目的片段纯化回收。5)回收目的片段与同样双酶切的表达载体连接，完成载体的构建。6)选取3个重组子送出测序，确认阅读框正确和碱基序列正确。4.载体转化和表达I)将经过测序鉴定正确的阳性克隆转入含有氨苄青霉素(100 yg/ml)的LB液体培养基中，200 r/min, 37 ° C培养过夜。2)利用 EZ Spin Column Plasmid Mini-Preps 44 Kit 提取质粒，在紫外分光光度计上测定其浓度，并将质粒稀释至10 ng/μ I。3)取I μ I稀释后的质粒转化200 μ I表达宿主菌BL21 (DE3)pLysS感受态细胞。4)将转化产物接入10 ml LB培养基中(含100 μ g/ml氨苄青霉素，34 μ g/ml氯霉素)，200 r/min, 37 ° C培养过夜。5)第二天将培养物转接入300 ml同样的培养基中，200 r/min，37 ° C培养1-3 h，中间每隔20分钟检测浓度一次，当0D600达到O. 5-0. 6时，加入终浓度为I mM的IPTG继续培养4 h。6)4 ° C,5000rpm,离心IOmin离心收集菌体沉淀。提取的适当菌体加入100 μ IPBS缓冲液后100 ° C沸水中煮IOmin后离心，取上清，进行15%的SDS-PAGE分离胶电泳分析，Coomassie brilliant blue R-250染色后用凝胶成像系统拍摄并记录结果。剰余菌体于-20 ° C冻存备用。5.重组蛋白的纯化本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.ー种泥蚶血红蛋白Tg-HbllA，其氨基酸序列为SEQ ID NO :1。2.—种核苷酸,用于编码权利要求I所述的泥紺血红蛋白Tg-HbIIA。3.如权利要求2所述的核苷...
【专利技术属性】
技术研发人员：包永波，林志华，董迎辉，
申请(专利权)人：浙江万里学院，
类型：发明
国别省市：
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