本发明专利技术涉及一种利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法。具体而言，提供了种子序列介导的可控遗传操作，用于在基因表达检测中筛选与特定microRNA相关的靶基因。在设定上游种子序列的互补序列和下游锚定序列的基础上添加特殊接头，通过反转录和特殊二步PCR将microRNA的靶基因扩增；扩增后的microRNA靶基因在聚丙烯酰胺凝胶电泳中检测其片段大小和表达丰度，用于筛选在不同生理状态或实验条件下特异表达的基因；特定的靶基因序列通过DNA回收和测序方法得到。此法可用于评估microRNA调节的基因或遗传途径，也可用表达谱来评估基因表达特征，在系统生物学研究中具有重要价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学基因表达调控领域，更具体的涉及利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，它适用于山羊同一组织细胞在不同发育时期、不同生理条件下microRNA介导的靶基因的差异筛选，或者不同组织细胞在相同的发育时期microRNA介导的靶基因比较研究。
技术介绍
microRNA是大约18_24bp的小的非编码RNA，它在转录后调控基因的表达。是1993年首次发现的一类在动植物中发挥重要作用的基因表达调控因子。它们通过依赖于microRNA和靶基因互补性的降解或者抑制翻译的两种不同机制负调控靶基因的表达水平。在大多数哺乳动物中，microRNA通过5’末端第2 8bp的序列互补配对祀基因mRNA,在翻译水平负调控基因的表达，5’末端的这2 Sbp的序列称为种子序列，它在各个物种中都是高度保守的，并且通过与靶mRNA完全互补配对介导基因的表达调控。许多研究表明正是microRNA 2 8bp种子序列的突变或者与之完全互补配对靶mRNA —个或者几个碱基的突变导致mi croRNA功能缺失，进而弓I起生理状态的改变。mi croRNA与靶基因组成复杂的调控网络，一个microRNA可以与多个祀基因相互作用，多个microRNA也可能作用于同一个革巴基因，另外microRNA及其靶基因不同时期、不同生理条件、不同组织其表达量均存在差异。因此，如何准确定位、分析microRNA靶基因成为许多科学家关注的问题。靶基因挖掘方法主要有两大类计算机预测和基于杂交的基因芯片。其中，计算机预测虽然快速、简单，但这种主要基于microRNA种子序列与其靶基因之间碱基互补配对的最小自由能的计算机方法，由于短小序列的存在，容易出现假阳性，需要大量的实验验证，且以表达谱数据已知为背景；基因芯片是基于杂交策略的主流技术，自专利技术以来，它一直在基因表达谱技术中占据优势地位。该技术利用过表达microRNA的样本及其对照的mRNA池与固定在芯片上的数以万计根据已知基因序列设计的探针杂交，以高通量的方式确定mRNA的种类和丰度，从而推测microRNA的靶基因。虽然该技术获得了广泛的应用，但是价格昂贵、需要大量的RNA，且存在数据处理过程噪音难以确定、探针与相似转录本间交叉杂交等问题。此外，由于要设计探针，它和计算机预测一样需要参考基因组序列信息。因此，为了研究山羊组织或者器官的HiiCT0RNA靶基因的情况，也为其它物种提供一种研究与某个microRNA相关的靶基因的分子方法，我们在miRBase已有数据的基础上，搜寻获得microRNA种子序列互补配对的序列,利用真核生物mRNA带有polyA尾巴的特点，在反转录酶作用下，加入带有特殊接头的反转录引物，合成第一链cDNA，然后，通过特异设计的两步PCR反应，富集与microRNA相互作用的所有靶基因，将其特异性扩增获得可以用常规凝胶检测到的核苷酸序列，并辅以PAGE技术，定位、分析与某个特异microRNA序列相互作用的靶基因。、
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种实验性的、简便快速的、高特异性的获取哺乳动物组织或器官miCToRNA靶基因的分子方法。包括以下步骤I)特异反转录引物的设计所述反转录引物包括锚定碱基VN (N代表A、T、C或者G ；V代表碱基A、G或C)、12个T、寡核苷酸CTGA(3’到5’端)以及特殊接头SEQ ID NO. 2。锚定碱基VN、12个T的寡聚核苷酸保证了 cDNA的从头合成，SEQ ID NO. 2的引入有利于特异两步PCR的设计。通过反转录引物将样本所有mRNA反转录成带有特殊接头SEQ ID NO. 2的cDNA。2)特异两步PCR反应所述特异两步PCR反应的引物由根据miRBasel6. 0数据库提供的与某个microRNA种子序列相互配对的核苷酸序列与特殊接头SEQ ID NO. I的上游引物，和待扩增cDNA上带有的特殊接头SEQ ID NO. 2的下游引物组成。为保证特异性，这两个特殊接头序列SEQ IDNO. I和SEQ ID NO. 2在动物基因组中或转录组中是不存在的。其中为了获得与某个microRNA相互作用的所有靶基因部份序列。第一步PCR过程中，我们利用哺乳动物microRNA 5’末端第2 8个碱基与其靶基因mRNA互补配对的特点，设计了特殊的上游引物，利用PCR反应过程中，低温条件下，引物3’末端几个碱基必然精确地与模板分子结合的原理，非特异性的富集了某个特异microRNA相互作用的靶基因，反应程序94°C预变性5分钟；94°C，40秒，37°C，30秒，72°C，I分30秒，5个循环；第二步PCR过程中，依据上下游退火温度的一致性，通过提高退火温度特异性的扩增某个microRNA相互作用的靶基因片段，反应程序94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72°C，I分30秒，32个循环；72°C，10分钟。其中，山羊组织microRNA靶基因挖掘流程如附图I所示(I)microRNA是长度为18 24bp的非编码的小RNA，它参与包括细胞增殖、凋亡、分化等许多的生物学过程，在转录后调控靶基因的表达。哺乳动物中，其作用方式是5’端第2 8个碱基的种子序列通过与多个靶mRNA完全互补配对以抑制靶基因的翻译。(2)真核生物的mRNA具有5’端帽子和3’端polyA尾巴的特点。利用这种特点，在反转录酶的作用下，加入特殊接头SEQ ID NO. 2的反转录引物组合，就能合成带有特殊接头 SEQ ID NO. 2 的 cDNA。(3)沿着箭头延伸的方向，以mRNA为模板、在反转录酶5’到3’聚合酶的活性作用下，从5’向3’合成mRNA与cDNA的杂合双链。(4)合成的杂合双链在反转录酶的RNaseH的作用下，降解杂合双链的mRNA，合成比较稳定的第一链cDNA。(5)加入包含特殊接头SEQ ID NO. I以及某个microRNA种子序列互补序列的引物组合，利用DNA聚合酶，退火温度为低温条件下，非特异性的合成与某个microRNA种子序列互补配对的全部的cDNA。(6)合成得到包含特殊接头SEQ ID NO. I以及某个microRNA种子序列互补序列、特殊接头SEQ ID NO. 2、12个碱基T以及锚定碱基NV，目的靶基因片段的特异DNA序列。(7)加入特殊接头SEQ ID NO. I以及某个microRNA种子序列互补序列的上游引物组合，以及特殊接头SEQ ID NO. 2的下游引物，利用DNA聚合酶的作用，在退火温度为高温的条件，特异的扩增目的靶基因片段。(8)通过多个PCR循环反应，合成得到可以通过常规手段检测到的多个目的靶基因片段，用于后面的分离、克隆、测序。(9) PCR产物通过PAGE检测和银染显色。3) PAGE凝胶及半定量分析PCR产物经过10% PAGE凝胶，120 140V电压，7 8小时电泳后，银(硝酸银)染显色，借助凝胶辅助分析工具(如genetool),半定量分析某个特异microRNA介导的革巴基因表达情况。每个泳道对应的条带可被切下并加以回收，利用原引物条件重扩增，克隆测序供进一步分析，反应程序94°C，5分钟；94°C，40秒，60. 5°C，30秒，72°本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.利用种子序列检测山羊组织或器官中micix)RNA靶基因的分子方法，其特征在于包括以下步骤 (1)合成反转录引物； (2)合成包含不同接头序列的上、下游PCR引物； (3)消化去除基因组污染，对样品总RNA的提取； (4)采用步骤(I)的反转录引物将样品RNA反转录获得cDNA； (5)采用步骤(2)上下游PCR引物，两步PCR法获得某一microRNA的靶基因序列； (6)PCR产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其片段大小和表达丰度； (7)切取靶基因条带，重扩增、回收、克隆、测序。2.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于涉及到的两条接头序列在山羊基因组中或转录组中不存在，分别具有SEQIDN0. I和SEQID NO. 2所示的核苷酸序列。3.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(I)所设计的反转录引物具有SEQID NO. 3所示的核苷酸序列，为接头SEQ ID NO. 2下游紧接4个动态碱基下游紧链接12个T以及锚定碱基NV的组合，其中，N代表A、T、C或者G ；V代表碱基A、G或C。4.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(3)中采用DNaseI消除基因组DNA污染。5.根据权利要求I所述利用种子序列检测山羊组织或器官中microRNA靶基因的分子方法，其特征在于步骤(4)以纯化的组织总RNA为模板，以SEQID NO. 3所示序列为反转录引物，在反转录酶作用合成带有SEQ ID NO. 3的cDNA。6.根据权利要求5所述反转录反应,其特征在于反转录体系如下总RNA4 u I,反转录SI 0. 5 u 1，反应缓冲液 2u I, SEQID NO. 30. 5 U I (50 u M)，RNase-free ddH20 3 u I ;反应条件37°C，15 分钟，85°C，5 秒。7.根据权利要求I所述利用种子...
【专利技术属性】
技术研发人员：付绍印，赵德超，张文广，李金泉，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：
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