DNA构建体以及用其制备重组CHO细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于有效地生产可用于生产靶蛋白质的重组CHO细胞的DNA构建体。该DNA构建体从5'端到3'端包括第一同源DNA片段、靶蛋白基因以及第二同源DNA片段。第一和第二同源DNA片段具有能够与CHO细胞基因组中的一部分次黄嘌呤-磷酸核糖基转移酶(hprt)位点进行同源重组的同源性，并且具有不小于1kbp的链长度。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于高效制备重组CHO细胞的DNA构建体，以及用其来制备重组CHO细胞的方法。
技术介绍
各种使用原核生物或真核生物作为宿主细胞的重组蛋白生产系统是公知的。在利用哺乳动物细胞作为宿主细胞的重组蛋白生产系统中，来自包括人类的高等动物的蛋白可以与其在体内合成类似的方式进行翻译后修饰，例如糖基化、折叠以及磷酸化。翻译后修饰是利用重组蛋白质进行天然蛋白生理活性的复制所必须的，并且利用哺乳动物细胞作为宿主的蛋白质生产系统普遍用于在特别需要具有这种生理活性的药物中所使用的重组蛋白生产系统。 目前，两种蛋白生产系统即CHO-DHFR系统和GS-NS0系统可称作使用能用于大规模生产的哺乳动物细胞的主蛋白生产系统。在这些生产系统中，通过将质粒载体内所含的选择性标记与合适的药物选择方法相结合来筛选可以实现整合到染色体中的质粒载体拷贝数增加的克隆。尤其是，在CHO-DHFR系统中，其表达水平增大了几十倍的细胞克隆可以使用选择性药物甲氨蝶呤通过两段筛选法来进行筛选。然而众所周知，上述蛋白生产系统存在着问题，例如，靶蛋白的表达水平并不仅仅总是随着扩增质粒载体的拷贝数量而按比例增加，而是需要花大量的时间来筛选表达水平提高的细胞克隆。此外，据报道，当在对表达水平提高的细胞克隆进行筛选之后在没有选择性药物存在的培养基中继续培养所选出的细胞克隆时，在大多数的克隆中可以观察到表达水平的降低或消失(PTL I JP 2002-541854T ；NPL I Kim, N. S. (1998)Biotechnol.Bioeng. , 60, 679-688)。此外，在采用哺乳动物细胞的靶蛋白生产系统中，在一般情况下，通过将含有靶蛋白基因的载体导入到宿主细胞中、筛选其中载体已整合到染色体中的细胞克隆，并且进一步在合适的培养条件下培养宿主细胞，从而来生产靶蛋白。整合到染色体中通常发生在随机的位置处，并且靶蛋白质的表达水平随所获得的细胞克隆而变化。此外，一些细胞克隆存在着例如他们不表达靶蛋白的问题。为了克服这一缺点，采用了这样一种方法，其中根据重组蛋白的表达水平来选择大量的克隆，并且选择最有利的克隆。然而这一筛选方法非常麻烦，需要投入大量的工作。用于避免这种棘手的工作且可快速选择有利的克隆的各种方法已有报道。例如，在一项公开的技术(PTL 2 JP 9(1997)-510865A)中，将载体整合到小鼠细胞的特异性染色体位置中。在重组细胞克隆池内通过载有与免疫球蛋白Y 2A位同源的碱基序列的序列的载体来产生同源重组细胞克隆。目标染色体位置先标识为一个当外源基因整合后可提供比随机整合更高的表达水平的位置。因此，当具有较高表达水平的同源重组细胞克隆在重组细胞克隆池中作为筛选目标而以给定的频率出现时，根据表达水平来进行筛选的工作就会减少。还公开了一种利用标记质粒的技术(PTL 3 JP 2001-516221A)。具有存在于标记质粒内的高表达水平的标记基因的克隆从通过标记质粒的随机重组得到的细胞克隆种群中预先获得。接下来，继承了标记基因表达水平的靶蛋白生产克隆通过选择细胞克隆来获得，在所述细胞克隆中，在载有靶蛋白基因的质粒载体和随机整合的标记质粒序列之间已经进行了位点特异性重组。上述技术对于减少选择具有高表达水平的克隆所需的工作是有利的。然而，例如当在不添加选择性药物的条件下对重组细胞进行连续培养时，由此获得的克隆是否可以长时间稳定地保持表达水平就无法预知了。 在药用蛋白的大规模生产中，蛋白的表达稳定地保持高水平是很重要的。尤其是从成本的角度以及从药用蛋白的认证和安全的角度考虑，稳定地维持表达水平是很重要的。为了将重组蛋白生产细胞用于大规模生产，有必要扩大生产细胞克隆的培养规模。据估计，在一般情况下，在开始培养后需要从克隆中立即进行至少约60次细胞分裂(NPL 2Brown, M. E. et al. (1992) Cytotechnology, 9, 231-236),并且表达水平会维持在恒定的水平。此外，选择性药物会造成更高的培养成本，同时还包括与为避免杂质混入药剂的可能性而进行的分离纯化过程有关的成本增长。因此，急需开发一种无需添加选择性药物就可以稳定地维持表达水平的细胞克隆制备技术。就算不考虑上述经济问题，也不能说对靶蛋白表达水平的稳定性已经进行了令人满意的技术研究。到目前为止，在很多用于制备蛋白生产系统的方法中，克隆的选择一直是基于长时间培养的生长率和产率的累积数据凭经验进行的。然而，这种经验性的克隆选择方法很难实现具有稳定表达水平的细胞克隆的获得(NPL 3 =Barnes, L. M. et al. (2003)Biotechnology and Bioengineering, 81，631-639)。在最近研究的一项技术中，靶蛋白基因特异性地整合到细胞基因组中的靶基因位点，以便有效地获得能够以稳定的方式长时间表达蛋白的重组细胞。hprt基因可以被看作是靶基因的一个示例。hprt基因被认为是位于例如人类的X染色体的长臂上的持家基因。细胞在剔除hprt基因后对药物6-硫鸟嘌呤(6TG)和G418具有抗性，因此很容易进行负选择。本专利技术的一些专利技术人曾报道，已经利用重组载体通过将靶蛋白基因导入到雄性人源HT1080细胞系的hprt位点而获得了在无选择性药物条件下可以长时间地稳定表达蛋白的重组细胞(PTL 5 JP2007-325571A ；NPL 4 =Koyama Y Et Al.，(2006) Biotechnology AndBioengineering, 95, 1052-1060)。据报道,在该文献的实验中，通过将大约Ι-kbp的第一同源DNA片段和大约Ι-kbp的第二同源DNA片段用作同源臂，每IO7细胞可以获得大约10克隆的重组细胞。 此外据报道，作为靶向imxi位点的另一个示例是靶向小鼠胚胎干细胞。不过，即使标靶是同一位点，基因打靶频率有时也会随培养细胞的类型而显著变化。例如，在 Porter C. G. ItzhakiJ. E, Eur. J. Biochem218, 273-281 (NPL 5)和 AnnualReport of the Hiroshima University Research Institute for Radiation Biology andMedicine, vol. 44(2003) (NPL 6)中报道了，胚胎干细胞和HT1080细胞的基因打靶频率和体细胞源培养细胞彼此不同，基因打靶频率很低。另一方面，在抗体药用蛋白生产系统中将CHO细胞用作宿主细胞，并且需要采用CHO细胞来构建高水平的和稳定的蛋白生产系统。然而，还没有关于在CHO细胞的imxi位点进行基因打靶的报道。只有关于使用CHO细胞的一个染色体上的迎Xi基因中有缺陷的特殊细胞系的研究(NPL 11 PNAS, 88, 9488-9502(1991) ；NPL 12: Somatic Cell. Mol. Genet. , 19, 363-375 ；NPL 13:PNAS, 86，4574-4578 (1989))。在这些实验中，其迎过基因只存在于一个染色体上的细胞系被用作宿主，而2. 6-4kbp的同源DN本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾根崎修司，大神有美，山名良正，成田纯也，
申请(专利权)人：TOTO株式会社，
类型：发明
国别省市：