本发明专利技术阐述了一种产乙偶姻菌株的筛选方法和用该菌株发酵法生产乙偶姻，属于生物工程技术领域。本发明专利技术菌株是将土样经过烘烤悬浮后稀释涂布，通过V-P实验进行定性分析筛选，并对筛选菌株进行生理生化及分子生物学鉴定，采用高效液相色谱法得到一株高产乙偶姻的解淀粉芽孢杆菌。本发明专利技术同时公开一种采用该菌株生产乙偶姻的方法，采用本方法发酵72h乙偶姻产量为35g/L。
【技术实现步骤摘要】
一种产乙偶姻菌株的筛选方法及应用该菌株生产乙偶姻，属于生物工程领域。
技术介绍
3-轻基丁酮(3-hydroxybutanone)又名乙偶姻，具有令人愉快的香味,可作为一种食用香料广泛应用在食品生产中，如用于奶油、咖啡的香味增强剂及配制乳品、草莓型香精等，也可作为微生物合成重要化工原料和液体燃料的2，3- 丁二醇及双乙酰的前体物质。此外，3-羟基丁酮还可作为一种平台化合物，广泛应用于其他众多行业，2004年美国能源部将其列为30种优先开发利用的平台化合物之一。因此，3-羟基丁酮作为一种重要的化 学合成中间体和多功能材料，广泛应用于食品、制药、化工等领域。其生产方法有化学合成法、酶转化法和微生物发酵法。其中，化学合成法已实现工业化生产，该法操作简单易行，但污染重、成本高、原料受石油制约、产品质量难以达到食用香料的要求。微生物发酵法具有生产成本低廉、对环境友好、产品纯度高、反应条件温和等优势，能解决化学合成法和酶转化法所面临的环境、资源、产品质量等问题受到越来越多的关注。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种乙偶姻生产菌及其筛选方法和用该菌株发酵法生产乙偶姻。本专利技术的技术方案I、一种产乙偶姻菌株的筛选方法从制酒作坊附近的土壤取土样，称取约5. 0g，在80°C的烘箱中烘烤48h，加入到200ml的无菌水中制成悬液。此菌悬液作为母液梯度稀释至10_6，取KT4-IO-6稀释菌液涂布于富集培养基上，37°C倒置培养24h，挑取不同菌落形态的单菌落进行V-P实验考察，将V-P阳性菌株逐一转接发酵培养基，并进行编号保存；培养结束后各取2mL，10000r/min离心lOmin，用HPLC法检测上清液中的乙偶姻含量，筛选出十几株产乙偶姻的菌株，其中菌株FMME044产乙偶姻的能力最强。2、根据权利要求I所述一种产乙偶姻菌株的筛选方法，其筛选得到产乙偶姻菌株的鉴定方法如下I)生理生化鉴定接触酶试验，V. P.及M. R.试验，明胶液化及淀粉水解，耐盐试验，硝酸盐还原试验;2) 16S rDNA分子生物学鉴定用细菌基因组提取试剂盒提取细菌基因组DNA，采用枯草芽孢杆菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，扩增产物用胶回收试剂盒回收纯化，并连接至克隆载体pMD 18 TVector，转化到大肠杆菌JM109中，利用克隆载体的青霉素抗性筛选到阳性转化子，并用通用引物对转化子进行质粒PCR鉴定。阳性克隆测序所得16S rDNA序列与GenBank数据库中的核苷酸序列进行同源性分析，得到与之亲缘关系最近的菌种Bacillus amyloliquifaciens,同源性达99%。通过生理生化及16S rDNA分子生物学鉴定确定该菌株为解淀粉芽孢杆菌，并命名为 Bacillus amyloliquifaciens FMME044。3、本专利技术公开的一种乙偶姻的生产方法，其特征是采用Bacillusamyloliquifaciens FMME044为出发菌株，以种子培养和液体发酵生产乙偶姻；I)种子培养 种子培养基以g/L计葡萄糖10，牛肉膏5，蛋白胨5，初始pH 7.0;培养条件温度37°C、摇床转速200rpm条件下，培养10-1 ；2)液体发酵培养发酵培养基以g/L计葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5，K2HPO4 3，MgSO4O. 4，初始 pH 7.0 ；发酵条件接种量10% (v/v)，温度37°C、摇床转速200rpm条件下，发酵60_72h。3) 7L发酵罐发酵培养发酵培养基以g/L计葡萄糖120，蛋白胨10，酵母粉10，NaCl 5，K2HPO4 3，MgSO4O. 4，初始 pH 7.0 ；7L发酵罐中发酵培养基装液量为4L，接种量10% (v/v)，温度为37°C，搅拌转速为400r/min，通气量为I. Ovvm，过程中不控制pH，培养时间32_48h。4、乙偶姻产量的测定取发酵液IOOOOrpm离心lOmin，收集上清液，并以乙偶姻作为标准品，配制1、2、3、4、5g/L的标准溶液。将上清液与标准溶液经0. 45 μ m微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱法测定乙偶姻的含量。色谱条件色谱柱AminexHPX-87H ；流动相5mmol/L稀硫酸,用0. 45 μ m滤膜过滤；柱温60°C;检测波长290nm；进样量20μ L流速0.6ml/min。标准曲线在l_5g/L之间呈现良好的线性关系(图I)，回归方程y = 0. 0027，R2=O. 9999。据此得到72h乙偶姻的产量为35g/L，如图I。附图说明图I乙偶姻标准曲线图2色谱检测结果，A 5g/L乙偶姻标样，B 32h发酵液具体实施例方式以下是解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquifaciens FMME044)筛选、鉴定及发酵生产乙偶姻的实施例。实施例I从制酒作坊附近地表取土样，称取约5. 0g，在80°C的烘箱中烘烤48h，加入到200mL的无菌水中制成悬液。此菌悬液作为母液梯度稀释至10—6，取10—4-10—6稀释菌液涂布于富集培养基上，37°C倒置培养24h，挑取不同菌落形态的单菌落进行V-P实验考察，将V-P阳性菌株逐一转接发酵培养基，并进行编号保存；培养结束后各取2mL，10000r/min离心lOmin，用HPLC法检测上清液中的乙偶姻含量，筛选出十几株产乙偶姻的菌株，其中菌株FMME044产乙偶姻的能力最强。 实施例2对筛选的FMME044菌株按《微生物分类学》进行生理生化特性鉴定(见表I)，并按细菌基因组提取试剂盒提取方法提取基因组DNA，以Pl和P2为正向和反向引物Pl :5' -CAGATGGGAGCTTGCTCCCTG-3'，P2:5' -CGACTTCACCCCAATCATCTG-3'。用PCR扩增16S rDNA基因，委托华大基因研究中心进行16S rDNA测序，得到本菌株部分16S rDNA序列后，在NCBI网站上用BLAST检索工具进行同源性比对分析。基于16SrDNA序列分析和生理生化特性鉴定，结合对该菌的生长和发酵特性研究，认为是解淀粉芽抱杆菌，命名为 Bacillus amyloliquifaciens FMME044。菌株FMME044 部分 16S rDNA 序列I gccaagagca tgacggcaag tggacgattc gacttcaccc caatcatctg tcccaccttc61 ggcggctggc tccaaaaagg ttacctcacc gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt121 gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta181 ctagcgattc cagcttcacg cagtcgagtt gcagactgcg atccgaactg agaacagatt241 tgtgggattg gcttaacctc gcggtttcgc tgccctttgt tctgcccatt gtagcacgtg301 tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggt本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，张燕婕，李树波，陈坚，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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