硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶及其用途制造技术

本发明专利技术为硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶及其用途，提供了重组多形拟杆菌GAG裂解酶多肽。本发明专利技术也提供了编码这种多肽的核酸分子、含有多形拟杆菌裂解酶核酸分子的重组表达载体以及引入表达载体的宿主细胞。也提供了利用本发明专利技术的组合物的特征、诊断和治疗方法。

【技术实现步骤摘要】
硫酸乙酰肝素粘多糖 裂解酶及其用途本申请为申请日为2006年11月3日、申请号为2006800502567、专利技术名称为“硫酸乙酰肝素粘多糖裂解酶及其用途”的分案申请。相关申请的交叉引用本申请是2005年11月3日提交的美国申请序号11/265,908的部分连续申请，并要求该美国申请的优先权。
技术介绍
肝素和硫酸乙酰肝素代表以连接至己糖醛酸的D-葡糖胺的线性多糖为特征的一类粘多糖(Linhardt, R. J. (1991)Chem. Ind. 2,45-50 ;Casu, B. (1985)Adv. Carbohydr.Chem. Biochem. 43，51-134)。肝素和硫酸乙酰肝素是在哺乳动物胞外基质中具有关键功能作用的碳水化合物复合物。这些多糖调节和调控重要的生化信号通路，所述信号通路作用于正常的生理过程，例如细胞和组织的形态发生、细胞-细胞相互作用以及生长和分化。这些多糖也在多种病理过程中具有关键作用，所述病理过程包括伤口愈合、肿瘤生长和转移、某些神经变性疾病和微生物引起的发病，在此仅举几个例子。现在对肝素和硫酸乙酰肝素序列的理解大多依赖于对其生物合成的研究(Linhardt, R. J. , Wang, H. M. , Loganathan, D. , and Bae, J. H. (1992)Biol. Chem. 267,2380-2387 ；Lindahl, U. , Feingold, D. , and Roden, L. (1986)Trends Biochem.Sci. 11,221-225 Jacobson, I. , and Lindahl U. (1980) J. Biol. Chem. 255, 5094-5100 ；Lindahl, U. , and Kjellen, L. (1987)in The Biology of Extracellular MatrixProteoglycans(Wight,T. N. , and Mecham R. ,eds)pp. 59-104,Academic Press,New York)。硫酸乙酰肝素与肝素在化学上相关，其出现在细胞表面上以及差不多每种哺乳动物细胞类型的胞外基质(extracellular matrix, ECM)中。这些肝素样粘多糖(heparin-like glycosaminoglycan, HLGAG)作为称作蛋白聚糖的蛋白-多糖共轭物存在于这种胞外环境中。逐渐认识到HLGAG不仅仅具有结构功能，因为它们以功能性方式与许多胞外机制的蛋白质相互作用，所述蛋白质例如层粘连蛋白、纤连蛋白、整合蛋白和胶原蛋白。这样，HLGAG(作为蛋白聚糖的一部分)协助限定基质的生物学特性。这些HLGAG也与胞外基质中的一列细胞因子样生长因子和形态发生素，通过协助其与受体的生化相互作用以及保护它们不被蛋白水解降解而相互作用。例如,如Thornton, et al. , Science 222,623-625(1983)报道的肝素控制aFGF的生物学活性，这可能是如Schreiber，et al. ,Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82，6138-6142 (1985)报道的通过控制aFGF对其细胞表面受体的亲和力。根据 Gospodarowicz and Cheng, J. Cell Physiol. 128,475-484(1986) ；Rosengart,et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun. 152,432-440(1988)；和 Lobb Biochem.27,2572-2578(1988)的报道，肝素保护aFGF和bFGF免于被热、酸和蛋白酶降解。根据Vlodavsky, et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84,2292-2296 (1987)和 Folkman, et al.，Am. J. Pathol. 130, 393-400 (1988)和 Emerson et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (14)4833-8(2004)的报道，bFGF储存在胞外基质中并可通过酶(例如乙酰肝素酶)的水解活性被动员为生物活性形式。如Yayon, et al. , Cell 64,841-848(1991)和 Papraeger, et al. , Science 252，1705-1708(1991)报道，FGF结合到硫酸乙酰肝素上是FGF结合到其位于细胞表面上的高亲和力受体的先决条件。如 Kiefer，et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA87,6985-6989 (1990)描述的，已发现特异的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖调节bFGF对细胞表面的结合。肝素裂解酶，例如肝素酶是能够特异性切割肝素和硫酸乙酰肝素中的主要糖苷键的一类酶。已经在肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)中鉴定了 3种肝素酶,所述肝素黄杆菌作为使用GAG的有机体也生产外切葡糖醒酸糖苷酶(exoglycuronidases)、糖苷酶、硫酸酯酶(sulfoesterases)和氨苯磺胺酶(sulfamidases)以及其他另外作用于裂解酶产生的低聚糖产物的其他酶类(Yang, et al. J. Biol. Chem. 260，1849-1857 (1987)； Galliher, et al. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 15,252-257 (1982)。这些裂解酶被称为肝素酶1(肝素酶，EC 4. 2. 2. 7)、肝素酶11(肝素酶，没有EC号)和肝素酶ΠΙ(肝素酶EC 4. 2. 2.8)。这三种纯化的肝素酶在其切割肝素和硫酸乙酰肝素的能力上不同肝素酶I主要切割肝素，肝素酶III特异切割硫酸乙酰肝素，而肝素酶II同时作用于肝素和硫酸乙酰肝素。几个拟杆菌属(Bacteroides)的种类(Saylers,et al.Appl.Environ.Microbiol.33,319-322(1977) ；Nakamura, et al.J.Clin.Microbiol. 26,1070-1071 (1988))也产生肝素裂解酶。Bohmer, et al. J. Biol. Chem. 265,13609-13617(1990)从一种未鉴定的土壤细菌中，根据明显同源性也纯化了肝素裂解酶。专利技术概述本专利技术部分地根据来自多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的粘多糖(glucosaminoglycan, GAG)裂解酶后文中称为“多形拟杆菌GAG裂解酶”的发现和重组表达，例如多形拟杆菌GAG裂解酶I、多形拟杆菌GAG裂解酶II、多形拟杆菌GAG裂解酶III和多形拟杆菌GAG裂解酶IV，其特别可用于肝素和/或硫酸乙酰肝素的结构特异性切割，并且在某些情况下用于硫酸软骨素和硫酸皮肤素的结构特异性切割。因此，本专利技术包括多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能片段以及多形拟杆菌GAG裂解酶或其功能片段的组合的方法、组合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯·迈特，
申请(专利权)人：莫曼塔医药品有限公司，
类型：发明
国别省市：