基于同源重组的核酸分子克隆方法及相关试剂盒技术

本申请提供基于同源重组的核酸分子克隆方法。按照本申请的方法，通过提供两端添加有分别与目标DNA两端序列或其侧翼序列同源的序列(即目标DNA特异性同源臂)的线性化载体，或者利用同时含有目标DNA特异性同源臂和载体特异性同源臂(与载体特定区域同源的序列)的连接片段，将目标DNA通过同源重组克隆到载体中。本申请的方法尤其适用于大DNA片段的克隆和单核苷酸多态性研究。本申请还提供相关的试剂盒。

【技术实现步骤摘要】

本申请涉及DNA重组
更具体而言，本申请涉及基于同源重组的核酸分子克隆方法、其应用以及相关的试剂盒。
技术介绍
在分子生物学研究和生物技术行业，始终需要将所需的DNA分子克隆至载体内，尤其是克隆在载体的特定位置。 将目标DNA克隆至诸如质粒之类的载体内预定位置的传统方法通常包括六大步骤(1)利用限制性核酸内切酶对载体DNA进行酶切，纯化线性化载体；(2)用小牛肠碱性磷酸酶(CIP)处理线性化载体，使连接过程中线性化载体的自环化程度最小；(3)利用PCR引物借助聚合酶链反应(PCR)扩增目标DNA，其中所述引物将在所扩增的目标DNA的5’和3’端添加使载体DNA线性化所用的限制性核酸内切酶的酶识别位点；(4)利用使载体DNA线性化所用的限制性核苷酸内切酶对所扩增目标DNA进行酶切，接着纯化经酶切的目标DNA ； (5)利用DNA连接酶将纯化的目标DNA与纯化的线性载体连接起来；以及(6)将连接产物转化到宿主细胞、例如大肠杆菌感受态细胞中，然后选择含有所要克隆产物的转化细胞，其中目标DNA于所需克隆位点插入至载体内。传统克隆方法繁琐、费时，克隆效率相对较低，也受限于载体和目标DNA上适当限制性内切酶识别位点的可用性。利用同源重组可大大提高基因克隆的效率。目前已有各种各样的基于同源重组的克隆方法。通常的作法是，首先通过PCR对目标DNA进行扩增，利用PCR引物在所扩增的目标DNA两端添加与线性化载体DNA两端同源的序列；然后在体外通过酶的作用，通过同源重组将PCR引物克隆到载体中，或者将线性化载体和PCR产物共转化或共转染到宿主细胞中，在体内酶的作用下，通过同源重组将PCR引物克隆到载体中。然而，现有的基于同源重组的克隆方法还存在一些问题，特别是在对来自真核生物的大片段基因组DNA进行克隆或对人基因组DNA中单核苷酸多态性(SNP)进行研究的情况下。例如，目前还难以通过PCR扩增IOkb以上的大片段基因组DNA。对于体内同源重组，由于其涉及将经PCR扩增的目标DNA片段与载体DNA分子共转化或共转染到宿主细胞中，导致转化率低下。另外，在进行SNP研究时，难以区分所检测出的单个核苷酸突变是基因组中本身存在的还是因PCR扩增人为引入的。因此，还需要能够解决这些问题的新的克隆方法。本申请通过提供一种基于同源重组的核酸分子克隆方法，解决了上述问题。
技术实现思路
本申请的一个方面提供基于同源重组的核酸分子克隆方法。在一个实施方案中，本申请提供将目标DNA克隆到载体中的方法，其包括 (a)将第一序列和第二序列分别添加到线性化载体的两端，其中第一序列与目标DNA的第一末端或其侧翼序列同源的序列，第二序列与目标DNA的第二末端或其侧翼序列同源的序列，获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体，所述第一序列和第二序列各自独立地长至少12个核苷酸，优选15-50个核苷酸，更优选35-50个核苷酸； (b)使延长的线性化载体与含有目标DNA的样品接触，通过同源重组将目标DNA克隆到载体中。在一个优选实施方案中，步骤(a)可以如下 进行 (i)提供第一引物、第二引物和载体，其中第一引物包含作为5’端的所述第一序列和作为3’端的对载体第一区域特异性的序列，第二引物包含作为5’端的所述第二序列和作为3’端的对载体第二区域特异性的序列，优选对载体第一区域特异性的序列为与载体第一区域互补的序列，优选对载体第二区域特异性的序列为与载体第二区域互补的序列；和( )将第一引物、第二引物和载体接触，以载体为模板通过聚合酶链式反应，获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体。作为聚合酶链式反应模板的载体可以为线性化载体，所述第一区域和第二区域优选分别为线性化载体的第一末端和第二末端。作为聚合酶链式反应模板的载体也可以为环状载体，优选聚合酶链式反应在解旋酶存在下进行。在另一个优选实施方案中，步骤(a)可以如下进行 (i)提供第一连接片段、第二连接片段和载体，其中第一连接片段具有与目标DNA第一末端或其侧翼序列同源的序列和与载体第一区域同源的序列，第二连接片段具有与目标DNA第二末端或其侧翼序列同源的序列和与载体的第二区域同源的序列；和 ( )将第一连接片段、第二连接片段和载体接触，通过同源重组获得两端分别具有第一序列和第二序列的延长的线性化载体。在另一实施方案中，本申请提供将目标DNA克隆到载体中的方法，其包括 (a)提供第一连接片段、第二连接片段和载体，其中第一连接片段具有与载体的第一区域同源的序列和与目标DNA第一末端或其侧翼序列同源的序列，第二连接片段具有与载体的第二区域同源的序列和与目标DNA第二末端的侧翼序列同源的序列；和 (b)将第一DNA片段和第二 DNA片段与线性化载体以及含有目标DNA的样品接触，通过同源重组将目标DNA克隆到载体中。在上述实施方案中，所述同源重组可以在核酸外切酶和单链DNA结合蛋白或退火蛋白或其功能上等同的酶存在下进行。所述核酸外切酶优选选自大肠杆菌核酸外切酶I、大肠杆菌核酸外切酶III、大肠杆菌核酸外切酶VII、λ噬菌体核酸外切酶、Τ7噬菌体核酸外切酶、Reda、RecE和它们的混合物。所述单链DNA结合蛋白或退火蛋白优选选自极端热稳定单链DNA结合蛋白(ET SSB), Rec A、T4基因32蛋白、嗜热栖热菌RecA (Tth RecA)、大肠杆菌单链DNA结合单链(SSB)、Red β、RecT和它们的混合物。同源重组可以在核酸外切酶和单链DNA结合蛋白或退火蛋白的任意组合下进行。在一个优选实施方案中，所述同源重组在RecE和RecT存在下进行。在另一个优选实施方案中，所述同源重组在Reda和Redii存在下进行。在进一步优选实施方案中，所述同源重组在RecE、RecT、Reda和RedP存在下进行。同源重组还可以在其他酶存在进行下。所述其他酶例如为解旋酶、核酸修复蛋白坐寸ο在再一实施方案中，本申请提供用于将目标DNA克隆到载体中的试剂盒，其包含(a)酶混合物，其包含核酸外切酶和单链DNA结合蛋白或退火蛋白；和(b)反应缓冲液。核酸外切酶可以是原核生物核酸外切酶或病毒核酸外切酶，优选选自大肠杆菌核酸外切酶I、大肠杆菌核酸外切酶III、大肠杆菌核酸外切酶VII、λ噬菌体核酸外切酶、Τ7噬菌体核酸外切酶、Red a、RecE和它们的混合物。单链DNA结合蛋白或退火蛋白可以选自极端热稳定单链DNA结合蛋白(ET SSB)、Rec Α、Τ4基因32蛋白、嗜热栖热菌RecA (Tth RecA)、大肠杆菌单链DNA结合单链(SSB)、Red β、RecT和它们的混合物。所述酶混合物可以包含核酸外切酶与单链DNA结合蛋白或退火蛋白的任意组合。在一个优选实施方案中，所述酶混合物包含RecE和RecT。在另一个优选实施方案中，所述酶混合物包含Reda和Red β。在进一步优选的实施方案中，所述酶混合物包含RecE、RecT、Red a 和 Red β。所述酶混合物还可以含有解旋酶和/或核酸修复蛋白。在一个优选实施方案中，所述酶混合物包含核酸外切酶、解旋酶、单链DNA结合蛋白或退火蛋白和核酸修复蛋白。在本申请的试剂盒中，反应缓冲液优选包含1 — 10 mg/mL的Tri本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于浩洋，
申请(专利权)人：深圳市中联生物科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：