本发明专利技术公开一种传染性造血器官坏死病毒分子标准样品的制备方法，其特征在于按如下步骤进行：提取传染性造血器官坏死病毒RNA；RT-PCR反应；目标基因的纯化；目的片段的连接转化；回收质粒；体外转录；转录后RNA纯化处理；酚氯仿抽提。本发明专利技术不仅制备过程省时省力，而且所制备的传染性造血器官坏死病毒核酸标准样品稳定性高、均匀性好，可以为传染性造血器官坏死病毒检测研究、医药研究、应用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种病毒分子标准样品的制备方法，尤其是一种省时省力、稳定性高、均匀性好的传染性造血器官坏死病毒分子标准样品的。
技术介绍
传染性造血器官坏死病毒属弹状病毒(Infectious haematopoietic necrosisvirus, IHNV)科的粒弹状病毒属(Novirhabdovirus),同属的水生动物病毒还有牙鲆弹状病毒(Hirame rhabdovirus, HRV)、體弹状病毒(Snakehead rhabdovirUS, SRV)和病毒性出血性败血症病毒(Viral haemorrhagic septicaemia, VHSV)。IHNV 是该属的代表种，IHNV 的代表株是WRAC株(ATCC编码为VR — 1392)，病毒粒子形态为弹状，直径8(T90 nm，长度为16(Tl80 nm,有囊膜；病毒核酸在硫酸铯中的浮密度为I. 59 g / ml,对热、酸、乙醚不稳定。传染性造血器官坏死病(Infectioushaematopoietic necrosis, IHN)是鲑、蹲等鱼类中的一种严重的传染性疾病，由于该病毒造成的危害极大，OIE将其列为重要传染病。我国是一个渔业大国，鲑鳟鱼类作为一种大型经济鱼类，在我国水产养殖业中占有相当重要的地位，同时进口的鲑鳟鱼量逐年增加，而传染性造血器官坏死病也被带入了我国，1990年，辽宁本溪首次报道了传染性造血器官坏死病在我国爆发。为了保护我国水产养殖业健康发展，需要对进口鲑鳟鱼类进行严格检验避免病毒流入，以及对国内已发现该病的养殖场进行疫情控制、防止疫情的传播恶化。在过去的十几年中，一些用于检测感染和非感染状态的IHNV的方法主要包括用核蛋白基因特异性的探针进行原位杂交、免疫组织化学、在体内进行检测的免疫金标记方法、ElISA和RT-PCR，在这些方法中，PCR被证明是最迅速和最灵敏的方法。但是，由于该病毒属于RNA病毒，其RNA极其容易被降解，各自实验室提取RNA病毒，不但费时费力，而且很难保持其稳定性和均匀性，难以保证实验室的质量控制。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种省时省力、稳定性高、均匀性好的。本专利技术的技术解决方案是一种，其特征在于按如下步骤进行 a.传染性造血器官坏死病毒RNA的提取 在离心管中加入Trizol裂解液600 μ 1，传染性造血器官坏死病毒细胞培养物200 μ 1，加入氯仿200 μ I震荡混匀，10 000 g离心15min ;吸取上清液500 μ I加入到500 μ I异丙醇中，反复颠倒混勻，10 000 g离心15min ;弃去上清,倒置于吸水纸上,沾干液体,加入75%的酒精600 μ 1，颠倒洗涤，10 000 g离心IOmin ;弃去上清，倒置于吸水纸上，沾干液体；4OOOg离心IOsec,吸干管底的液体,室温干燥3 min ;加入11. 5 μ I的DEPC水,轻轻混勻，溶解管壁内的RNA，2 OOOg离心5sec，4°C保存，做为模板备用； b.RT-PCR 反应b-1.反转录体系5 X M-MLV Buffer 4μ1, dNTPs (各 2· 5mmol/L) 2μ1, M-MLV (5υ/μ1) μ , RNA 酶抑制剂O. 5μ1，反转录引物(20pmOl/>L) Wl，a步骤所得RNA模板11. 5μ1 ;所述反转录游引物是5’ -TCAAGGGGGGAGTCCTCGA-3’，总反应体系为 20μ1 ；b-2.反转录条件42°C水浴lh 2h ；b-3. PCR扩增反应体系IOXPCR Buffer (含 Mg2+) 2. 5μ1, dNTPs (各 2. 5mmol/L) O. 5μ1, Taq DNA 聚合酶(5U/μ ) μ ，上游引物、下游引物(20pmol/>L)各WL，b-2的反转录产物O. 5μ1，用无菌水补充至 25μ1 ； 所述上游引物是 5 ’ -TCAAGGGGGGAGTCCTCGA-3，； 所述下游引物是 5’ -CACCGTACTTTGCTGCTAC-3’ ； b-4. PCR扩增条件94°C预变性3min ;94°C变性lmin，53°C退火lmin，72°C延伸I. 5min，30 个循环；72°C 5min ； c.目标基因的纯化 米用 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. O 试剂盒,回收目标分子DNA片段； d.目的片段的连接转化 d-Ι连接体系 c步骤所得到的纯化的目的片段4μ1, 2XRapid ligation buffer 5μ1, PGEM-T载体O.5μ1，Τ4 DNA Ligase O. 5μ1，室温连接 Ih ；d-2转化 将上一步骤的连接产物加入到感受态细胞中，混匀，冰浴20min，42°C热应激IminJK浴2min，加入800μ1 SOC培养基，150g摇菌I. 5h，I OOOg离心lOmin，弃去培养液，加入新鲜的SOC培养基200μ1，混匀后涂在含有Amp+的LB平板上，风干后，37°C倒置培养12tTl6h ；d-3阳性克隆的筛选 挑取单克隆菌进行培养，用PCR方法进行阳性克隆的筛选，PCR体系及反应条件如b-3、b-4 ； e.回收质粒； f.体外转录 将e步骤所得质粒用SalI进行单酶切，反应体系为10XH Buffer 5μ1，Sail μ ，质粒 ομ ,双蒸水34μ1 ；37°C 2h,用Omega回收试剂盒回收线性化质粒；转录反应体系为10X T7 RNA polymerase buffer 5μ1, DTT 5μ1, NTP 10μ1, Rnasin μ ，线性化质粒 5μ1，Τ7 RNApolymerase μ ，DEPC 处理水 28μ1 ;37°C 2h，然后再加入 IOU DnaseI 2μ1,37°0,30min ； g.转录后RNA纯化处理 对转录的RNA进行DNase处理，反应体系及条件如下所述f步骤的转录反应液20ul、RNase free DNase I (5u/ul) 4 ul、Total 24ul, 37°C Ih ； h.酚氯仿抽提对所述g步骤经DNase处理的反应液进行酹氯仿抽提,最终用RNase-free dH20补足至 100 ulο本专利技术不仅制备过程省时省力，而且所制备的传染性造血器官坏死病毒分子标准样品稳定性高、均匀性好，可以为传染性造血器官坏死病毒检测研究、医药研究、应用研究等提供标准样品，以实现不同实验室结果的比对，从而保证实验室的质量控制。附图说明图I是本专利技术实施例传染性造血 器官坏死病毒目的片段电泳图。图2是本专利技术实施例传染性造血器官坏死病毒菌液PCR电泳图。图3是本专利技术实施例传染性造血器官坏死病毒线性化质粒电泳图。图4是本专利技术实施例传染性造血器官坏死病毒线性化质粒体外转录产物电泳图。图5是本专利技术实施例传染性造血器官坏死病毒线性化质粒体外转录产物变形后电泳图。具体实施例方式根据OIE和《GB/T 15805. 2-2008鱼类检疫方法第2部分传染性造血器官坏死病毒(IHNV)))中的本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜雄伟，李叶，
申请(专利权)人：大连民族学院，
类型：发明
国别省市：
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