川楝素在制备抗肿瘤靶向药物中的用途制造技术

本发明专利技术公开了川楝素在制备抗肿瘤靶向药物中的用途。揭示了人源脱氧胞苷激酶（HumanDeoxycytidinekinase，dCK）作为治疗肿瘤相关疾病的药物靶标及其突变体在开发抗肿瘤靶向药物中的作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于药物领域，涉及一种抗肿瘤靶向药物，尤其是川楝素在制备抗肿瘤靶向药物中的用途。
技术介绍
靶向治疗是指根据已知肿瘤发生中涉及的异常分子和基因，设计针对这些特定分子和基因靶点的药物，选择性地杀伤肿瘤细胞。而化学治疗虽然可以起到明显的抗肿瘤作 用，但其在杀伤肿瘤细胞的同时，也会大面积的杀伤机体的正常细胞，与传统的化学治疗相t匕，革巴向治疗正以其低毒副反应和高治疗效果成为肿瘤治疗研究的热点。川楝素是一种从传统的驱蛔中药楝科植物川楝Melia Toosendan Sieb. et Zucc或楝Melia azedarach L.的树皮或种子中提取的一种四环三職类化合物,具有驱蛔、杀虫、抗肉毒效应、抑制神经递质释放等多种生物活性，广泛应用于农业、医药等行业。近年研究发现，川楝素具有凋亡作用，但是川楝素在肿瘤细胞内的作用靶标仍不是很明确，靶标所参与的信号转导途径尚不清楚，这个问题对于进一步川楝素的抗肿瘤作用，开发抗肿瘤靶向药物具有重要的指导意义。人源脱氧胞苷激酶是嘧啶补救合成途径中的一类关键酶，它能够磷酸化其天然底物dC, dG, dA。除此之外,它还能单磷酸化一些核苷类似物药物前体,使其能够继续三磷酸化其活性形式，结合于DNA链上，抑制DNA聚合酶的活性，终止DNA链的延伸，造成DNA链断裂。最早发现并用与临床的核苷类似物抗肿瘤药物为阿糖胞苷C(Ara-C)，其机制为Ara-C被DCK单磷酸化，继而被其它酶催化为Ara- CTP，进而干扰肿瘤细胞DNA的合成。继此之后，又出现一些新的核苷类似物，如福达他滨，吉西他滨等。研究表明此类核苷类似物抗药性的增加与DCK基因缺陷或其它原因导致的活性缺失有关系，DCK能够催化这些核苷类似物穿膜磷酸化的第一步。由于DCK发挥着如此重要的作用，关于其活性及其抑制剂的研究也越来越多。而目前关于DCK作用的报道也仅限于DCK干扰DNA的合成，进而用于癌症治疗及抗病毒化学治疗。这些药物出现的抗药性通常与DCK的活性丧失或者降低有一定的关系。已有研究发现，DCK与免疫疾病的发生也有一定的关联，它在胸腺及骨髓均有很高的表达水平，预示其在淋巴细胞生成中的作用不可小视。在DCK基因缺陷的小鼠中胸腺及淋巴细胞的数量较野生型小鼠明显减少。而关于DCK在细胞凋亡方面的作用并没有相关报道。因此，综合利用多种手段，阐明DCK在体内新的作用具有重要的意义。目前，寻找药物靶蛋白的方法主要有亲和色谱法、噬菌体展示克隆、酵母三杂交系统、药物印记、DNA芯片技术、磁性纳米探针技术等。其中，亲和色谱法是最经典的一种方法，常见的亲和色谱法有固相特异性洗脱法和药物竞争法。但固相特异性洗脱法易受到“亲和柱-靶蛋白”复合体解离速度的影响，而且还须制备无活性结构类似物药物的对照柱。药物竞争法由于蛋白会随不溶的药物沉淀，对药物溶解性的要求很高。系列亲和色谱法近几年才报道的一种新的能克服以上缺点的亲和色谱法，至今尚未应用于天然化合物的靶标发现。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的是提供一种抗肿瘤靶向药物的制备，即，川楝素的一种新的应用。 为达到上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案是川楝素在制备抗肿瘤靶向药物中的应用。上述技术方案中，以人源脱氧胞苷激酶作为药物靶标。其中川楝素(Toosendanin，C3tlH38O11),分子量为574. 62。川楝素类似物主要包括羊毛脂烷型如茯苓酸、块苓酸和羊毛脂醇；达玛烷型如棒锤三萜A和人参、三七以及西洋参中均含有的人参皂苷；阿菠萝蜜型如环黄芪醇苷；大戟烷型如大戟烷、橄榄科乳香属的乳香二烯酮酸和异乳香二烯酮酸；葫芦烷型如血胆甲素、血胆乙素；原帖烷型如泽泻萜醇A和泽泻萜醇B。川楝素使脱氧胞苷激酶的构象发生变化而使其活性增加。由此获得一种人源脱氧胞苷激酶的突变体。其中， 人源脱氧胞苷激酶的氨基酸序列中第35位丝氨酸突变成谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺； 人源脱氧胞苷激酶的氨基酸序列中第74位氨基酸突变成谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺； 人源脱氧胞苷激酶的氨基酸序列中第128位精氨酸突变成谷氨酸、丙氨酸。上述靶向药物涉及的肿瘤类型主要包括乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌和胰腺癌以及淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。相关的肿瘤细胞主要包括来自于人的前列腺、肝、中枢神经、血液、肺及大鼠肾上腺的多种肿瘤细胞株如PC3，BEL7404, SH-SY5Y，U251，HL-60, U937, A-549，MDA-MB-468，PC12, K562 等。本专利技术在研究川楝素抗肿瘤的分子机理的过程中，采用HL-60细胞为研究对象，探索川楝素抑制HL-60细胞增生和促进其凋亡的分子靶点。利用Pull-down实验验证了 TSN与靶蛋白为特异性结合用连接有TSN于柱材S印horaSe-4B为分子探针，采用系列亲和色谱的方法，特异性吸附与HL-60肿瘤细胞内的靶蛋白，并对蛋白进行质朴鉴定，鉴定结果为这种靶蛋白为脱氧胞苷激酶(DCK)。DCK是含两个大小为30. 5kDa的相同亚基的二聚体，含260个氨基酸，其折叠构型与黑腹果蝇的核苷激酶(dNK)和人的dGK相类似，每个单体含5个β折叠，并以此为中心周围围绕着10个α螺旋，每个单体的第4个和第7个α螺旋形成一个4个螺旋组成的二聚体界面。由于DCK具有的对抗肿瘤的核苷类似物药物的磷酸激酶活性，近几年对于其活性以及作用的研究越来越多，而本专利技术中提到的其作为抗肿瘤药物川楝素的靶点还是第一次。本专利技术在确定了 TSN的祀蛋白为DCK之后,采用Promega公司的Kinase-Glo 激酶活性检测试剂盒进一步在体外验证了 TSN对DCK的相互作用。该试剂盒是一种通过激酶和底物反应，均质荧光素酶检测的方法。荧光素酶反应中需要ATP的参加，激酶的磷酸化也需要消耗ΑΤΡ，激酶反应结束，加入等体积的Kinase-Glo 试剂，测量发光信号。发光信号与体系中剩余的ATP成正比，与激酶活性成反比。该方法中，激酶为DCK，底物为dC。反应体系中，除了加入反映的激酶和底物，还加入了另外一种小分子，即TSN。有许多种方法可以用来检测激酶的活性，如生物发光，荧光和放射性标记法，而后两种方法在使用的时候，各有局限性，生物发光法因其易于操作，低背景值而且发光值的输出不受荧光复合物的干扰而被应用的越来越广泛，而大多数报 道都是直接在体系中加入酶以及其底物或是抑制剂而反应酶活，在其中加入另外的小分子还是监测其对酶活是否有影响还没有报道。本专利技术实验结果表明，TSN可以对DCK起到一定的激活作用，而且TSN的加入量与DCK的活性增加程度具有正相关性(TSN浓度由12. 5μΜ到100 μ M两倍倍比递增)，实验结果表明，随川楝素浓度的增加，DCK的活性分别提高到原来的106. 78%，108. 87%，113. 30%, 116. 12%，与对照组相t匕，均有显著性差异。有文献报道，DCK74位丝氨酸的自磷酸化可以提高其自身的活性，因此有针对该位点进行氨基酸定点突变的DCK突变体，本专利中，采用定点突变的方法，构建了 DCK的8个突变体，目的是明确TSN对DCK起到激活作用的机制。除3个已有报道(S74E，S74A，S74Q)，另外的5个均未有报道(S35E，S35A，S35Q，R128E，R128A)。其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：齐智超，鞠建明，刘楠，陈依军，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：