本发明专利技术公开了汉防己甲素在制备诱导癌症细胞自噬的诱导剂上的应用。本发明专利技术采用不同浓度汉防己甲素对肝癌细胞BEL-7402、HepG2和Huh7处理，通过蛋白质杂交和吖啶橙染色，观察不同浓度汉防己甲素对诱导肝癌细胞形成自噬的能力。结果表明，不同浓度的汉防己甲素都能诱导肝癌细胞形成自噬，且呈浓度和时间依赖效应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，涉及汉防己甲素在制备诱导癌症细胞自噬的诱导剂上的应用。
技术介绍
恶性肿瘤与心血管疾病是导致人类疾病和死亡的两个最大顽疾。恶性肿瘤中肺癌、胃癌、食管癌、肠癌、肝癌、宫颈癌、乳腺癌、白血病、恶性淋巴瘤、鼻咽癌等在我国是常发性肿瘤，且以肺癌、胃癌、食管癌、肝癌、乳腺癌、宫颈癌最为多见，约占全部恶性肿瘤的70% — 80% ο癌症治疗的传统方法中有放疗、化疗、手术；然而放疗、化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也对人体正常细胞有损伤，毒副作用大且造成患者生活质量差、生存率低。因此，筛选高效低毒的抗癌药物一直是癌症治疗的重要研究课题，特别是设计专门针对肿瘤细胞特定信号途径或特定癌细胞靶位点的药物。随着研究者对细胞死亡现象本质的探究，尤其是对细胞凋亡分子机理的阐明，使人们对抗癌药物的筛选及其作用机理有了全新的认识。有目的地诱导肿瘤细胞的凋亡已成为一种治疗肿瘤的有效手段。汉防己甲素(Tetrandrine，分子式C38H42N2O6,分子量 622.75，CAS 号 518-34-3，以下简写为Tet)，又称粉防己碱，是从中草药粉防己的根块中提取的双苄基异喹啉类生物碱。临床上常用于治疗高血压，肝纤维化和矽肺等疾病。近年来，一些研究表明较高浓度的汉防己甲素可诱导肿瘤细胞凋亡，显示其具有潜在的抗肿瘤活性，如对人白血病细胞株HL-60、人白血病U937细胞、人肝癌细胞Mahlavu、人恶性淋巴瘤BM13674细胞、人神经胶质瘤细胞U138MG、鼠神经母细胞瘤Neuro 2a有抑制肿瘤细胞增生和诱导凋亡的作用；研究结果还表明，汉防己甲素可以通过提高细胞内活性氧水平抑制鼠神经母细胞瘤株生长，诱导其凋亡；在HT-29细胞中汉防己甲素通过PI3K/AKT/GSK3beta途径诱导细胞周期阻滞和凋亡。Tet不仅能直接抑制肿瘤生长，并且具有放疗增敏、逆转耐药、减轻放化疗毒副反应的作用，表明Tet在抗肿瘤治疗中有着良好的临床应用前景。与以往报道不同，在本专利技术中，体内外实验发现汉防己甲素能在较低浓度下诱导肝癌细胞发生自噬，且有显著的剂量效应和时间依赖关系。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供了汉防己甲素在制备诱导癌细胞自噬的诱导剂上的应用。所述的癌细胞为肝癌细胞。本专利技术的实验研究发现，低浓度的(彡5 μ M)汉防己甲素可有效诱导肝癌细胞发生自噬，且有显著的剂量效应和时间依赖关系。本专利技术可用于诱导多种肿瘤细胞，不仅限于实例中所列举的肿瘤类型。本专利技术通过汉防己甲素在低浓度下(彡5μΜ)诱导肝癌细胞BEL-7402、HepG2和Huh7自噬，研究汉防己甲素对肝癌细胞的诱导自噬的能力。本专利技术采用不同浓度汉防己甲素对肝癌细胞BEL-7402、HepG2和Huh7处理，通过蛋白质杂交和吖啶橙染色，观察不同浓度汉防己甲素对诱导肝癌细胞形成自噬的能力。结果表明，不同浓度的汉防己甲素都能诱导肝癌细胞形成自噬，且呈浓度和时间依赖效应。附图说明图I不同浓度的Tet处理肝癌细胞，Western blot检测细胞凋亡和细胞自噬的标志性蛋白。肝癌细胞Bel7402、Hep G2和Huh7经不同浓度的Tet处理24小时后，Westernblot 检测细胞内 PARP、Caspase-8、Caspase_3、LC3 蛋白。GAPDH 作为内参。图2三种肝癌细胞经5 μ M Tet处理不同时间后，吖啶橙染色并在荧光显微镜下观察。图3统计分析Tet处理不同时间后Bel7402肝癌细胞自噬比例。图4统计分析Tet处理不同时间后!tepG2肝癌细胞自噬比例。图5统计分析Tet处理不同时间后Huh7肝癌细胞自噬比例。图6 Tet处理Bel7402肝癌细胞引起细胞自噬的肿瘤组织电镜照片(标尺为800nm ;处理组箭头自噬溶酶体)。 图7 Tet处理H印G2肝癌细胞引起细胞自噬的肿瘤组织电镜照片(标尺为1300nm;处理组箭头自噬溶酶体)。 图8 Tet处理Huh7肝癌细胞引起细胞自噬的肿瘤组织电镜照片(标尺为800nm;处理组箭头自噬溶酶体)。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。所有实施例所用细胞的培养、药品的添加以及癌细胞自噬均按以下方法进行。一、材料 I.细胞株肝癌细胞BEL-7402、HepG2和Huh7等细胞株均购自中国典型培养物保藏中心(China Center for Type CultureCollection, CCTCC)。2.试剂DMEM培养基、RPMI 1640培养基、胎牛血清和胰酶、乙二胺四乙酸等药品来自GIBCO公司；汉防己甲素、青霉素、链霉素、DMSO、、Sigma公司产品。其余试剂均为国产分析纯。LC3抗体购自sigma公司；细胞色素C, Atg5, Atg7, caspase-3, caspase-8,caspase-9, PARP, phospho-Akt, phospho-ERK, p38 MAPK 和 JNK 等抗体均为 CellSignaling公司产品；吖啶橙、GAPDH抗体为碧云天公司产品；二抗羊抗兔IgG-HRP为Beyotime公司产品；二抗羊抗鼠IgG-HRP为Beyotime公司产品； 3.仪器5% CO2细胞培养箱(ThermoForma，美国)，细胞培养超净工作台(苏净集团安泰公司)，低温超速离心机(Haraeus公司，德国),倒置突光显微镜(Olympus,日本),透射电子显微镜(日立一H 600型)。二、主要试剂配制I)将汉防己甲素用二甲亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)配制成1(Γ2Μ储备液,小量分装，一 20 1贮存备用，临用时用相应细胞培养液稀释到所需终浓度。2) 一抗/ 二抗工作液一抗/ 二抗均用封闭液以1:1000比例稀释，4°C保存。3)PBS溶液将购买的PBS粉剂溶于5L三蒸水中，磁力搅拌器混匀，高压蒸汽锅灭菌，4°C保存。4)青霉素/链霉素溶液用PBS将青霉素和链霉素配制成10，000U/mL,用0. 22 μ m滤膜过滤除菌，_20°C保存。 5) DMEM-高糖细胞培养基DMEM粉剂溶于10L三蒸水中，磁力搅拌器中搅拌0. 5小时后，加入37g NaHCO3，继续搅拌0. 5小时，用稀盐酸将pH值调到7. 04-7. 05，真空泵抽滤除菌。培养细胞DMEM含10%的胎牛血清和1%的青霉素/链霉素。6) 5%牛奶封闭液称取5g的脱脂牛奶溶于IOOmL双蒸水中，磁力搅拌器混匀，分装后-20°C保存。7) TBS 缓冲液(10X) Tris. Base 150g, KCl 10g，NaCl 400g，加双蒸水至 5L，磁力搅拌器搅拌至其完全溶解，用HCl调pH调至7. 4，室温保存。8) TBST缓冲液TBS缓冲液(10X) IOOmL,加双蒸水至1L，再加lmLTween-20，摇匀。9) Tris-甘氨酸电泳缓冲液(5X) :75. 5g Tris. Base，360g 甘氨酸，5g SDS，加双蒸水至5L，磁力搅拌器搅拌至其完全溶解，过夜，调pH调至8. 3-8. 8，4°C保存。使用时，取IOOmL加双蒸水至1L，摇匀。10)Western blot 转移缓冲液(10X) Tris. Base 151. 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李文化，梅运军，刘鑫，龚克，陈超，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：
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