一种白灵菇与杏鲍菇种间杂交种的鉴定方法技术

本发明专利技术属于生物工程领域，解决了现有技术中筛选白灵菇与杏鲍菇的种间杂交种比较困难的技术问题。提供了一种白灵菇与杏鲍菇种间杂交种的鉴定方法，包括一个制备菌株原生质体的步骤，一个将原生质体进行培养的步骤，一个将原生质体中的菌丝进行培养与收集的步骤，一个提取菌丝中的基因组DNA的步骤，一个将提取后的DNA进行ITS-PCR扩增的步骤，一个将扩增产物进行特异酶切片的步骤，一个将酶切产物的电泳检测的步骤，经电泳检测，如果产生分子量为675～685bp、585～5950bp和85～95bp的DNA标记条带，则说明该菌株是白灵菇与杏鲍菇的种间杂交种。本发明专利技术的鉴定方法，检测时间短、准确性高、容易判断、稳定性好。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程领域，涉及一种食用菌杂种的鉴定方法，具体是
技术介绍
灵鬼 iPleurotus nebrodensis (Inzengae) Qu6l)腐生或寄生在伞形科阿魏属多年生草本植物阿魏草(ferula)的根莖基部或根部。杏鲍燕ipleurotus eryngii(DC. :Fr.) Qu6l)发生于伞形花科刺芹属，刺芹枯死的植株上。二者同属于侧耳属(Pleurotus)。白灵菇和杏鲍菇不仅有很高的营养价值，口感风味好，而且还有很高的药用价值，市场前景广阔。但白灵菇的组织致密性、口感、朵形颜色优于杏鲍菇，而风味、生长周期、生物转化率和生产管理条件劣于杏鲍菇。为了快速筛选白灵菇与杏鲍菇的种间杂交种，同时为保护白灵菇与杏鲍菇种间杂交种这一新品种，有必要探索鉴定白灵菇与杏鲍菇种间杂交种真伪的技术。
技术实现思路
针对现有技术中的上述缺陷，本专利技术提供了，通过本专利技术的方法可以容易的从菌菇中筛选出白灵菇与杏鲍菇的杂交种。本专利技术一种白灵燕与杏鲍燕种间杂交种的鉴定方法，包括一个制备菌株原生质体的步骤，一个将原生质体进行培养的步骤，一个将原生质体中的菌丝进行培养与收集的步骤，一个提取菌丝中的基因组DNA的步骤，一个将提取后的DNA进行ITS-PCR扩增的步骤，一个将扩增产物进行特异酶切片的步骤，一个将酶切产物的电泳检测的步骤，经电泳检测，如果在一个泳道上同时显示分子量为675 685bp、585 5950bp和85 95bp的DNA标记条带，则说明该菌株是白灵菇与杏鲍菇的种间杂交种，如果在一个泳道不是同时显示分子量为675 685bp、585 5950bp和85 95bp的DNA标记条带，则不是白灵菇与杏鲍菇的的种间杂交种。进一步的，在一个将提取后的DNA进行ITS-PCR扩增的步骤中，ITS-PCR扩增反应体系为1 μ L 含量 50 100 ng 的 DNA，2.5 μ L 10XPCR buffer, 2 μ L 浓度为 2· 5 mmol/L 的 dNTP, I μ L 浓度为 10 μ mol/L 的 ITS1, ITSl 序列为 5，-TCC GTA GGT GAA CCTGCG G-3M μ L 浓度为 10 μ mol/L 的 ITS4，ITS4 序列为 5’ -TCC TCC GCT TAT TGA TATGC_3，，0.3 μ L 酶活为 5 U/uL 的 Taq DNA Polymerase, 17. 2 μ L ddH20，ITS-PCR 扩增反应程序94°C预变性5 min;94°C变性45 s，55°C退火45 s，72°C延伸I min，35个循环；72°C延伸10 min。进一步的，在一个将扩增产物进行特异酶切片的步骤中，在8 12 μ I ITS-PCR扩增产物中加入2 μ I AluI 酶的酶切 Buff er，O. 8 I. 2μ I AluI 酶，5 9. 8 μ I ddH20，37°C 水浴4 7h。进一步的，在一个将酶切产物的电泳检测的步骤中，取AluI酶的酶切产物15 u L，与3 ii L上样缓冲液混匀，点样于I. 2%的琼脂糖凝胶上，于0. 5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳。进一步的，经电泳检测，如果在一个泳道上同时显不分子量为675 685bp、585 5950bp和85 95bp的DNA标记条带，则说明该菌株是白灵菇与杏鲍菇的种间杂交种。为了筛选出朵形同白灵菇、栽培性状同杏鲍菇的新品种，通过本专利技术的方法可以鉴定出白灵菇与杏鲍菇之间的种间杂交，极大促进了白灵菇事业的发展，增加了新品种资源。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显而易见的。本专利技术的白灵菇与杏鲍菇种 间杂交种的鉴定方法具有如下的优点 I、检测时间短该检测所需时间短，一般只需要2 10天。2、准确性高、稳定性好本专利技术以基因组DNA为材料，DNA是稳定的遗传物质，是区分物种的本质表现所在，而DNA序列中的保守序列更是稳定，是物种长期进化的分子标记，不易受外界因素等的影响，因此以保守序列开发的鉴定方法准确性高，稳定性好。3、容易判断本专利技术的判断依据是在琼脂糖电泳上出现的DNA标记条带,DNA标记条带少、清晰，一目了然。附图说明 图I为AluI酶的酶切电泳图；M 3为泳道编号；左侧的数字表示M泳道DNA片段的分子量。其中，I 3泳道中显示的分子量为677bp、587bp和9Ibp的DNA标记条带，是白灵恭与杏鲍燕种间杂交种菌株的标志。具体实施例方式为了充分公开本专利技术的白灵菇与杏鲍菇种间杂交种的鉴定方法，以下结合实施例加以说明。本专利技术所使用的主要试剂如下(所有化学试剂均为分析纯)1、CTAB抽提液100mmol/L Tris-HCl, 2. 0% CTAB, 20 mmol/L EDTA, I. 4 mol/L NaCl,pH 8. 0 ；2、CTAB沉淀液50 mmol/L Tris-HCl, I. 0% CTAB, 10 mmol/L EDTA, pH 8. 0 ；3、CTAB/NaCl:0.7 mol/L NaCl, 10% CTAB ；4、TE缓冲液10 mmol/L Tris HCl , I mmol/L EDTA ；5、0.5XTBE :44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HB03、1 mmol/L EDTA ； 6、上样缓冲液0.1%溴酚蓝，40%蔗糖； 7、EB10 mg/ml 溴化乙锭；8、ITSl:5，-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3，；9、ITS4:5’ -TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ； 10、PCR扩增试剂及酶均购自大连宝生物公司。本专利技术所使用的主要仪器如下 Sff-CJ-IFB型单人水平垂直两用净化工作台苏州净化设备有限公司手提式灭菌锅上海三申医疗器械有限公司 HYG-A全温摇瓶柜太仓市实验室 冷冻离心机Sigma 3K30 PCR 扩增仪Eppendorf AG22331 Hamburg 掌型离心机江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-IOO手掌型离心机 SDC-6节能型智能恒温槽宁波新芝生物科技股份有限公司 凝胶成像系统TAN0N-2008 实施例I (一)、白灵菇与杏鲍菇亲本菌株选择、原生质体制备、原生质体融合 选取优质、高产的白灵菇菌株和杏鲍菇菌株作为杂交亲本； 1、白灵菇单孢菌株原生质体制备用PDA斜面培养基活化白灵菇单孢菌株，转接于含IOOmL PDA液体培养基的250 mL广口三角瓶中，25°C静置培养6 7d，用移液枪取5 7HiL培养液于含IOOmL PDA液体培养基的250 mL广口三角瓶中，25°C静置培养6 7d，挑取O.3 O. 6g幼嫩菌丝放入5mL离心管内，5000r/min离心IOmin,倒弃离心出来的液体,在5mL离心管内加入300ul溶壁酶酶液，置28 30°C水浴锅中酶解2 2. 5h，用塞有棉花的注射器过滤酶解液，得到白灵菇单孢菌株原生质体； 2、杏鲍菇双核菌株原生质体制备用PDA斜面培养基活化杏鲍菇双核菌株，余下步骤同白灵菇单孢菌株原生质体制备； 3、将制备好的白灵菇单孢菌株的原生质体倒入直径为90本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨开耀，邓优锦，余作茂，
申请(专利权)人：上海百茸食用菌有限公司，
类型：发明
国别省市：