本发明专利技术公开了长链扣手探针的生物合成方法。该生物合成的基本方法是：首先根据设计的扣手探针序列，应用PCR法合成扣手探针前体。扣手探针前体的5’端带有双链DNA限制性内切酶识别序列，而扣手探针前体的3’端带有双链DNA单链切刻酶的识别序列。然后将该前体连接到用于纯化扣手探针的专用载体pOCP中，转化大肠杆菌并繁殖该质粒，质粒经过酶切、聚丙烯酰胺凝胶电泳、回收、纯化、冻干脱水等步骤，最后得到高质量的长链扣手探针。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及ー种。
技术介绍
扣手探针(Padlockprobes)又称为开环探针(Open circle probes),其与 生物芯片技术结合，现在已发展出一种高通量的单核苷酸多态性(Single nucleotidepolymorphisms SNP)分型技术。SNP是人类遗传多样性中最广泛存在的多样性,这些分子遗传上的变化与人类的健康和疾病密切相关。开环探针就是没有闭合的环形探针，是一条5’末端被磷酸化的寡聚核苷酸，其5’末端和3’末端各有长度为15-20nt (核苷酸)的序列与模板序列互补配对，3’末端带有ー个等位基因特异的碱基，当与互补序列完美配对后，在T4DNA连接酶的作用下，其5’末端与3’末端被连接形成环形的分子，不能与互补序列完美配对的开环探针不能环化，依然保持开环状态。目前，扣手探针的合成主要有两种方法ー种是化学合成，另ー种是基于PCR(Polymerase chain reaction)的酶法合成。基于扣手探针与生物芯片的SNP分型技术要求高质量的扣手探针，这种扣手探针除了序列没有错误之外，还要求完整的5’末端与3’末端，并且扣手探针长度在IOOnt以上。化学合成5’端磷酸化的长链扣手探针所面临的障碍主要是第一，化学合成的质量与产量随着扣手探针的长度的增加而降低，在化学合成中，每ー步的合成效率大约是99%，因此，对于含有150个核苷酸的扣手探针，总的合成效率大约是0. 99149 = 0. 22 ;第二，随着扣手探针长度的増加，其纯化的难度也上升。现有的PAGE与HPLC纯化方法是根据寡核苷酸的长度来纯化的，随着寡核苷酸长度的増加，全长寡核苷酸与缺失1-2个核苷酸的非全长的寡核苷酸通过PAGE或者HPLC纯化方法很难完全分开，同时也不能区分出现合成错误的全长的寡核苷；第三，随着扣手探针长度的増加，其出现的ニ级结构可能性也加大，而ニ级结构也降低PAGE和HPLC的纯化效率；第四，化学合成长链扣手探针的成本很高。而基于PCR法合成的扣手探针，其主要缺点是合成量小，大量合成成本极高，同时，部分探针的3’末端不完整。因此，寻求新的合成长链扣手探针是ー种必然。
技术实现思路
本专利技术的ー个目的是提供长链扣手探针生物合成方法。本专利技术提供的方法，包括如下步骤A、在扣手探针主体片段两端分别添加与待测基因5’端互补的DNA片段I和与待测基因3’端互补的DNA片段2，得到探针前体；所述DNA片段I的5'末端含有双链DNA限制性内切酶MlyI识别位点，所述DNA片段2的3'末端含有双链DNA单链切刻酶Nb. Bts I识别位点；所述扣手探针主体片段为如下I或II :I的核苷酸序列 为序列表中序列I自5’末端第24-125位寡核苷酸；II的核苷酸序列为序列表中序列2自5’末端第24-125位寡核苷酸；B、将步骤A)得到的探针前体插入pOCP载体的多克隆位点间，得到重组载体；C、用双链DNA限制性内切酶MlyI和双链DNA单链切刻酶Nb. Bts I酶切步骤B)得到的重组载体，即得到扣手探针。步骤A)中，所述在扣手探针主体片段两端分别添加与待测基因5’端互补的DNA片段I和与待测基因3’端互补的DNA片段2的方法包括如下步骤I)将探针主体片段拆分成如下24nt-52nt的小片段，人工合成所述各小片段Aspl_Com CTCGTGTATGTCACGTGGCTAACTGGTCCAGTAGAGGTGGTCAGGCAATG ；Link_Aspl GACATACACGAGCTCCCTTTGTAG ；Tag_7897 TGCGTCGGTAGAATGAGGTATTGTGGGTACTGGGTCTGAACTACAAAGGGAG ；Asp2_Com GCAGGATCTTACTCCGCAATAACTGGTCCAGTAGAGGTGGTCAGGCAATG ；Link_Asp2 GTAAGATCCTGCCTCCCTTTGTAG ；2)连接Aspl_Com、Link_Aspl、Tag_7897，得到探针主体片段I的互补片段(探针主体片段I的互补片段与探针主体片段I反向互补)；或连接Asp2_Com、Link_Asp2、Tag_7897，得到探针主体片段II的互补片段(探针主体片段II的互补片段与探针主体片段II反向互补);3)以探针主体片段I的互补片段为模板，7897A_F1和7897A_R1为引物，进行PCR扩增，得到第一轮PCR产物，以第一轮PCR产物为模板，7897A_F2和7897A_R2为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物1，即为探针前体I ;或以探针主体片段II的互补片段为模板，7897A_F1和7897A_R1为引物，进行PCR扩增，得到第一轮PCR产物，以第一轮PCR产物为模板，7897A_F2和7897G_R2为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物2，即为探针前体2 ；所述7897A_F1 的核苷酸序列如下所示CTCGITCTGGCTTAGGCAITGCCTGACCACC ；所述7897A_R1 的核苷酸序列如下所示GAAAGCTGTGAAAGGTGCGTCGGTAGAATG ；所述7897A_F2 的核苷酸序列如下所示GAGTCTTCCTAGTCTITCTCGITCTGGCTTAG ；所述7897A_R2 的核苷酸序列如下所示GCAGTGAGAGCGGAAAGCTGTGAAAGG ；所述7897G_R2 的核苷酸序列如下所示GCAGTGGGAGCGGAAAGCTGTGAAAGG ；步骤B)中，所述多克隆位点为EcoRI识别位点； 所述pOCP载体的核苷酸序列为序列表中的序列5 ；步骤C)中，还包括如下步骤4)将所述酶切得到的酶切产物凝胶电泳分离，回收146nt的片段；5)将步骤4)得到的146nt的片段，进行反向层析，收集层析洗脱液，冻干，即为扣手探针。步骤B)中，所述凝胶电泳采用5% (质量百分含量)尿素变性聚丙烯酰胺凝胶；步骤C)中，所述反向层析中采用如下溶液进行洗脱将30ml己腈和70ml去离子水混合得到的溶液；所述反向层析中采用的层析柱为Sep_PakC18柱。上述的方法制备得到的扣手探针也是本专利技术保护的范围。上述的方法在合成5’端磷酸化的长寡聚核苷酸中的应用也是本专利技术保护的范围，所述长寡聚核苷酸为大于IOOnt的寡聚核苷酸。本专利技术的另ー个目的是提供一种扣手探针。本专利技术提供的探针，从5’至3’依次为与待测基因5’端互补的左侧寡核苷酸、探针主体片段和与待测基因3’端互补的右侧寡核苷酸；所述探针主体片段为序列表中序列I自5’末端的第24-125位寡核苷酸或序列表中序列2自5’末端的第24-125位寡核苷酸。所述与待测基因5’端互补的左侧寡核苷酸为序列表中序列I自5’末端的第1-23位寡核苷酸或序列2自5’末端的第1-23位寡核苷酸；所述与待测基因3’端互补的右侧寡核苷酸为序列表中序列I自5’末端的第126-146位寡核苷酸或序列表中序列2自5’末端的第126-146位寡核苷酸；所述扣手探针的5’末端磷酸化，具体为所述左侧寡核苷酸自5’末端起第一位核苷酸的第5位C上连接磷酸基团。含有所述扣手探针的试剂盒也是本专利技术保护的范围。含有所述扣手探针及其互补链的重组载体或重组菌也是本专利技术保本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：漆小泉，赵松子，曹晓花，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：
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