本发明专利技术提供了用于检测与癌症和其它疾病相关的染色体重排的多重（+/-）链分析，例如阵列比较基因组杂交（aCGH）。例如，一个示例性的用于CGH的多重阵列包括离散的正(+)链和负(-)链DNA探针，所述探针彼此互补但在CGH阵列上彼此分离。由于许多基因从负（-）链被转录，因此负（-）链DNA探针能够恢复常规微阵列所丢失的诊断信息。在一个示例性系统中，使用能够在样品中产生DNA的正（+）链和负（-）链的广泛的引物，通过扩增和标记，来制备用于CGH的患者和对照DNA样品。可以通过一种极性的DNA探针在多重微阵列上检测易位染色体的断点，而通过互补极性的相应DNA探针可以检测与易位区域有关的DNA拷贝数变化。还提供了识别易位伙伴基因的相关方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术通常涉及多重(+/_)链阵列，如(+/-)链比较基因组杂交阵列，以及它们在检测染色体异常，例如检测平衡的染色体易位中的应用。
技术介绍
比较杂交方法检测的是两个核酸与第三靶标核酸相互作用的能力。具体而言，比较基因组杂交(CGH)是用于检测染色体异常的一种方法。起初开发的CGH是用于检测和识别增加(gain)或者丢失(loss)的DNA序列的位置，例如，常见于肿瘤中的缺失、复制或者扩增(Kallioniemi et al. , Science 258:818-821,1992)。例如，引起一个或者多个染色体的数目异常的基因改变(即非整倍性)已经提供了有用的人类疾病的诊断指征，特别是作为癌症标志物。染色体拷贝数的改变几乎存在于所有人类主要的肿瘤类型中(参见例如 Mittelman et al. , " Catalog of Chromosome Aberrations^inCANCER, Vol. 2 (ffiley-Liss, 1994)。早期的CGH技术是在用不同的颜色标记的测试DNA和正常参照DNA之间使用竞争性原位杂交和中期染色体分散。通过检测两种不同颜色的信号比例发生改变的区域，能够快速地确认比正常参照DNA拷贝数增多或者减少的测试DNA内的染色体区域。例如，测试细胞中拷贝数已经减少的这些基因组区域的测试DNA会表现出比参照DNA(与基因的其它区域(如缺失区域)相比)更低的信号；然而，测试细胞中拷贝数已经增多的区域(例如复制区域)的测试DNA却表现出相对较高的信号。当拷贝数的减少或增多限于I个拷贝的序列的丢失或增加时，CGH的分辨率通常为5-10兆碱基(Mb)。 最近，已将CGH发展为分析个体基因组核酸序列，而不是中期染色体分散。个体核酸序列被排列在固体载体上，并且该序列能够代表一个或者多个染色体区域的整体、染色体或者整个基因组。使用不同的标记，例如两种颜色的荧光，对标记的核酸与阵列靶标的杂交进行检测。因此，使用多个个体核酸序列的基于阵列的CGH使得可以获得比染色体分散更多的特定信息，可能更为灵敏，并且使样本的分析更加方便。例如，在一个典型的基于阵列的CGH中，将测试样品和正常参照样品的细胞中适量的总基因组核酸用两种不同颜色的荧光染料标记，并与含有总体覆盖细胞基因组的克隆核酸片段的BAC(细菌人工染色体)阵列共杂交。所得的共杂交产生一个荧光标记阵列，所述荧光标记阵列的着色反映了测试基因组DNA和参照基因组DNA的序列与阵列BAC中的同源序列的竞争杂交。理论上，测试基因组核酸样品和参照基因组核酸样品中的同源序列的拷贝数比例应该与它们各自在阵列内的各个离散BAC处的着色荧光信号强度成正比。例如，美国专利No. 5，830, 645和No. 6，562，565描述了基于阵列的CGH，其中使用固定在固体载体上的靶核酸代替中期染色体分散。虽然CGH是基因分析的一个强有力的工具，但是CGH还没有成功的适用于广泛检测平衡染色体易位事件。染色体易位是一类遗传异常，当遗传物质从一个染色体区域转移到另一个染色体时就会发生这种遗传异常。某些易位的表型影响可能较小或者不明显；然而，某些易位产生较严重的表型后果，包括细胞转化、智能缺陷、不孕、先天性畸形以及生理缺陷。当这种“平衡”易位发生在细胞的两个或者多个染色体之间时，通常没有遗传物质的净增加或者丢失。这会导致这样一种变化，即所述变化依靠常规的通过DNA拷贝数的变化(如复制、缺失)来提供可见结果的aCGH分析不能检测到。当这种易位与致癌相关时，通常易位的一种产物为生理相关，而且重排后的染色体会表达异常的嵌合蛋白。另有一种结果是，基于易位引起的表达变化，正常的蛋白的表达会失去控制，而且该蛋白的过度表达和/或过度活性可能会引起疾病的表型。相互易位，即在其他配对染色体上交换的DNA链的其他区段，通常对癌细胞或者患者的预后没有生理影响。通过阵列CGH检测染色体易位的一些尝试已有记载。例如美国专利申请No. 11/288982，申请人为Mohammed(美国专利申请公布No. 20070122820),申请名称为“Balanced translocation in comparative hybridization (比较杂交中的平衡易位)”,该申请描述了使用一个或多个特定的探针来检测平衡易位的杂交。设计这种探针的目的是与易位的移动基因组区段互补，或可以与异位断点的区域互补。使用aCGH检测已知的基因组基因座处的平衡易位在国际专利申请PCT/US2008/083014(W0 2009/062166)中也有记载，该申请的申请人为Greisman，申请名称为“DNA Microarray Based Identification and Mapping of Balanced TranslocationBreakpoints (基于DNA微阵列的平衡易位断点的识别和做图)”。Greisman描述了以已知的易位断点热点例如，MYC和BCLG外显子I附近为靶标的线性扩增引物。也就是说，与预定易位断点相关的基因组DNA序列经过线性扩增变成了杂交DNA片段或“探针”，这种杂交DNA片段或“探针”从一个基因组基因座开始、延伸通过易位断点并进入与易位伙伴基因座中。在没有反向引物的一个类PCR反应中，使用热稳定聚合酶，线性扩增可以通过两个易位染色体之间的断点。这种扩增使用了与DNA退火的基因特异性引物。在扩增过程中，引物作为DNA聚合酶的起点来合成一个新DNA链。将扩增的患者DNA用一种颜色标记，扩增的对照DNA用另一种颜色标记，从而进行aCGH过程，即将扩增的患者DNA进行标记并且与具有不同标记的基因组参照DNA —起进行阵列杂交。在某些特定的情况下，例如，当用Greisman所述的技术来识别免疫球蛋白重链(IgH)易位时，扩增的和标记的基因组DNA与经设计而代表伙伴基因座的嵌合密度(tiling-density)的寡核苷酸阵列的杂交,使得Greisman技术能够鉴别易位配对,而且能够以常规的高分辨率对基因组断点进行作图。当读取该CGH阵列时，应该能够观察到，由于扩增产物移向另一个染色体，患者DNA在断点后有所下降。在易位配偶体扩增的阵列上应该也能够观察到患者DNA的相应增加，而对于没有发生易位的对照DNA，应该观察不到上述趋势。由于在扩增中并不必需以配对基因座为靶标的第二引物，在某些情况下，Greisman技术可以可以使用单个阵列检测散布在较大基因组区域和多个伙伴基因座中的易位断点。由于扩增的正常基因组DNA被用作阵列杂交的参照样品，在某些情况下， Greisman技术能够检测到相同阵列上的基因组不平衡和平衡易位。Greisman技术使用由仅为阳性或者“正”(+)DNA链组成的常规的aCGH阵列，该阵列仅能够使正(+) DNA链(在标记过程中变为负(-)链)与常规阵列进行杂交。常规aCGH阵列使用的基因组DNA在当开始于染色体的上臂或短臂时，根据DNA上链进行编号。正(+)链也可被称为有义链、编码链或非模板链。正(+)链是与mRNA具有相同序列的DNA链(除了其具有T碱基而不是U碱基外)。另一种被叫做负(-)链、反义链或者模板链的链与mRNA互补。然而，这些编号或命名本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：利萨·麦克丹尼尔，布莱克·巴立夫，罗杰·舒尔茨，布赖斯·台布斯，巴塞姆·贝贾尼，利萨·沙福尔，
申请(专利权)人：基因诊断测试公司，
类型：发明
国别省市：
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