本发明专利技术公开了一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。这对转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)由一对DNA识别蛋白分别与Fok1?DNA内切酶的两个异源亚基融合得到，可以特异性地识别山羊或绵羊朊蛋白基因(PRNP)exon2上的两个相邻位点。将这对转录激活子样效应因子核酸酶同时转入宿主细胞时，其能对宿主细胞PRNP基因的exon2位点打靶，并使打靶位点发生基因突变，从而实现对山羊或绵羊PRNP基因的靶向修饰，具有特异性强、打靶效率高、准确度高等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一对转录激活子样效应因子核酸酶及其编码基因与应用。
技术介绍
按照人类的意愿对基因组进行定向靶向修饰一直是许多科学家的梦想。在内源的基因组上特异地删除或加入我们需要的序列，一方面可以构建出各种动物模型用于生物学基础研究和疾病机理研究，另ー方面可以生产动物反应器用以廉价生产我们需要的又很难从其他途径得到的生物组分。朊蛋白类疾病，也叫传染性海绵状脑病，是ー类致命的传染性中枢神经系统退行性疾病，主要包括发生在绵羊和山羊的羊搔痒病，发生在牛的牛海绵状脑病(即疯牛病)，以及发生在人的克雅氏病(CJD)、G综合症、致死性家族失眠症(FFI)等。动物基因组编码的朊蛋白(prpC，一种锚定在神经细胞、淋巴细胞和别的细胞外表面的膜糖蛋白)是ー种与传染性海绵状脑病的发生直接相关的分子。虽然已有实验证明缺失PrpC的小鼠不仅能够正常发育和繁殖后代并且具有抵抗传染性海绵状脑病的能力，然而缺失PrpC的大型动物，尤其是那些在自然条件下可以自发感染该类疾病的大型动物，目前的研究距离实用性差距仍然很远。2001年英国的科学家使用绵羊胎儿成纤维细胞基因打靶再通过体细胞克隆获得了四只Prnp+/-的羊羔，但其中三只都在出生后死亡，存活最久的也仅仅在世12天。2004年Kuroiwa等使用胎牛成纤维细胞敲除了牛编码PrP的基因。2006年，Golding MC等利用RNAi干涉技术针对引起牛疯牛病和羊搔痒病的PRNP基因序列设计有效的siRNA，获得ー头转基因羊胎儿，对其检测发现siRNA很好地抑制了体内PRNP基因的表达。我国科学家也致カ于羊瘙痒症的研究，成国祥等获得了 5只成活的Prnp+/-山羊。此后，他们将Prnp+/-的成年山羊体细胞进行二次基因打靶，将获得的Prnp-/-体细胞进行克隆，但仅仅获得了孕73天的Prnp-/-山羊胎儿，未得到成活的转基因羊。从中我们可以推測Prnp+/-山羊的繁育情况并不容乐观，二次基因打靶加再次的体细胞克隆的难度远远大于Prnp+/-山羊的自然交配获得纯合体。目前为止，虽然国内外的科学家们付出了艰苦的努力，但仍未获得Prnp-/-的成年羊。此外，绵羊和山羊虽然都可能得羊瘙痒症，但该病是主要发生于绵羊中的，而绵羊与山羊是同科而不同属的动物，绵羊和山羊之间不能交配产羔，因此获得PRNP基因敲除的绵羊是具有重要的科学和经济价值的。但人们一直没有找到简单高效的方法对基因组进行基因组靶向修饰。传统的基因打靶技术依赖于细胞内自然发生的同源染色体随机交換，其打靶效率非常低，通常只有10_6-10_8，这种打靶方法只在小鼠中得到了广泛了应用，而在其他模式动物及大型哺乳动物中都因效率太低而得不到广泛应用。近年发展很快的序列特异的核酸酶可以用于精确的基因组靶向修饰。一般由序列特异的核酸酶由ー个DNA识别结构域和ー个非特异性核酸内切酶结构域构成。原理是首先由DNA识别域把核酸酶定位到需要编辑的基因组区域，然后非特异性核酸内切酶切断双链DNA从而造成DNA双链断裂(double-strand break，DSB)，引入的DSB激活的DNA自我修复可以引起基因的突变和促进该位点DNA同源重组。锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases,ZFN)是现在研究最清楚也是应用最广的序列特异的核酸酶。其原理是两个锌指蛋白特异识别两段相隔5-7bp的DNA序列，并把与之融合表达的非特异性DNA切割蛋白Fokl的两个单聚体定位到了一起，DNA切割蛋白形成双聚体时可以切断该位置的双链DNA，从而造成DSB0 ZFN的出现使基因组靶向修饰技术向前迈进了一大歩，然而，ZFN技术还存在靶向不确定性、效率低、拖把率高等问题，研究者很难自行设计出特异和高效的靶向基因组目的序列的锌指核酸酶仍然是制约ZFN广泛应用的瓶颈。而商业购买高效特异的锌指核酸酶又价格昂贵(20万人民币/基因)，一般研究者或商业公司根本无法承受这笔费用。2009年两个研究组发现植物病原体Xanthomonas中的ー种可以调节植物基因表达的转录激活子样效应因子(transcription activator-like effector, TALE)表现出DNA 结合特异性，而其识别密码具有模块化和简单化的特点，为科学家们开发出更简易的新型基因组祀向修饰技术带来了新希望。TALE与Fokl融合后即形成转录激活子样效应因子核酸酶(transcriptionactivator-like effector nucleases, TALEN)。TALEN 的打革巴原理与 ZFN 相同，只是识别特异DNA的蛋白不同。TALEs由数十个特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列組成。每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，第12和13位残基是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的di-residues (RVDs)位点。然而不同于姆个锌指蛋白识别特异性的三联体碱基，TALEs上的每个RVDs仅能识别ー个碱基。Sangamo BioSciences公司和哈佛大学的两个研究小组分别利用TALEs技术进行了基因组靶向修饰相关研究，两篇研究论文发表在同一期的《自然生物技木》(NatureBiotecJinology)杂志上。Edward Rebar领导的研究小组将带有不同C-末端TALE的截短片段连接到核酸酶FokI的催化结构域上。当研究人员将构建的TALENs靶向内源性的人类NTF3和CCR5基因吋，证实TALENs能够特异性地对这些基因片段进行剪切。哈佛大学研究小组开发了ー种基于分层连接的策略来构建包含12个重复模块的TALEs。他们在保留RVDs的基础上减少了每个模块的DNA序列，同时将剩余序列的重复性降到最低。进而通过12重PCR获得了带有特异性连接序列的単体，并将其克隆至包含TALE N-末端和C-末端序列的骨架载体中。为了构建TALE转录因子，研究人员又将TALE融合到一个转录因子的激活域。在接下来的靶向性检测中，研究人员证实其能特异地使四个检测内源基因中的两个基因表达上调。今年7月MIT的Rudolf Jaenisch小组也验证了 TALEN在人胚胎干细胞和人iPSC中的打靶效果。其通过在五个位点的TALENs与之前其在相同位置的ZFNs的打靶效果作对比，得出五组TALENs在打靶效率和精确度上都与从Sangamo BioSciences公司购买的ZFNs相似，进ー步验证了 TALENs是非常好的基因组编辑工具。
技术实现思路
本专利技术提供了一对短肽，利用这对短肽构建获得的一对转录激活子样效应因子(TALE)能够特异性地识别山羊或绵羊朊蛋白基因(PRNP)基因组上的ニ段相邻核苷酸；利用这对转录激活子样效应因子构建获得的一对转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)，能够对山羊或绵羊朊蛋白基因进行准确、高效地打靶。一对短肽，所述ー对短肽分别具有如SEQ ID NO. I和SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列。本专利技术提供了ー对多核苷酸，所述ー对多核苷酸分别编码上述的ー对短肽。优选地，所述ー对多核苷酸分别具有如SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4所示的碱基序列。其中，所述的多核苷酸由分别识别山羊或绵羊朊蛋白基本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：肖磊，庄庆刚，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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